內(nèi)毒素血癥大鼠血清nf-與心肌細(xì)胞凋亡的關(guān)系

近年來(lái)的研究表明，當(dāng)受感染動(dòng)物感染時(shí)，首先產(chǎn)生的炎癥介質(zhì)是腫瘤壞死因素（tnf），尤其是tnf-e。脂多糖(LPS)是引起感染性休克機(jī)體損傷的主要物質(zhì),可對(duì)機(jī)體形成廣泛的影響及損傷,并引起心率減慢、心肌收縮力下降,嚴(yán)重影響心功能1材料和方法1.1許可證及試劑180只健康Wistar大鼠,不分雌雄,體重為(20±2)g,購(gòu)買(mǎi)于華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,許可證號(hào)為:SCXK(鄂)2004-0007。EPO(產(chǎn)品序號(hào)CSB-E04539m)以及ELISA試劑盒購(gòu)于武漢華美生物工程有限公司,脂多糖LPS購(gòu)于SIGMA公司,產(chǎn)品序號(hào)L2880。用于TUNEL法檢測(cè)原位凋亡的Insitucelldeathdetection試劑盒購(gòu)于德國(guó)Boehringer-Mannheim公司。1.2大鼠心肌組織病理學(xué)檢測(cè)將180只Wistar大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、脂多糖LPS組及EPO處理組,每組60只,每小組分成2h、4h、6h、12h、24h五個(gè)亞組,每個(gè)亞組12只。脂多糖LPS組給予腹腔注射LPS0.5mg/kg,對(duì)照組大鼠給予腹腔注射等量生理鹽水,EPO組大鼠給予腹腔注射LPS0.5mg/kg及EPO4000U/kg。各亞組大鼠在所對(duì)應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)斷頭取血0.5mL,離心保存在-20℃冰箱等待檢測(cè)。并即刻解剖取其心臟保存在-20℃冰箱。采用ELISA法測(cè)定血清TNF-α,用TUNEL法檢測(cè)原位凋亡。1.3測(cè)定心肌組織tnf-表達(dá)血清TNF-α濃度的測(cè)定:采用雙抗體夾心ELISA法。TNF-α的濃度單位以pg/mL表示,試劑盒購(gòu)于武漢華美生物工程有限公司。嚴(yán)格按照試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行試驗(yàn)操作,顯色以后從全自動(dòng)酶標(biāo)儀上直接讀數(shù)得到TNF-α濃度值。心肌細(xì)胞凋亡的測(cè)定:選用大鼠的左心室心肌行石蠟切片,嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。每只大鼠觀察10張切片,每張切片在光鏡下(×400)隨機(jī)選10個(gè)視野,圖像分析用MICRO-COS-MOSMiVnt圖片分析系統(tǒng),得到陽(yáng)性細(xì)胞百分率及陽(yáng)性細(xì)胞胞漿胞核的平均光密度值(MOD),算出細(xì)胞凋亡指數(shù)AI(AI%=MOD×陽(yáng)性細(xì)胞百分率×100)。1.4心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)測(cè)定采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,TNF-α濃度及心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)均為定量資料,采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ue0af±s)表示,運(yùn)用方差分析;相關(guān)分析采用簡(jiǎn)單相關(guān)分析法。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1lps和epo對(duì)tnf-表達(dá)的影響LPS組TNF-α的濃度在2h時(shí)達(dá)到最大值,且明顯高于生理鹽水對(duì)照組(P<0.05),隨后TNF-α濃度開(kāi)始下降,并在6h時(shí)降到正常,與生理鹽水對(duì)照組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。LPS+EPO組TNF-α濃度在2h時(shí)達(dá)到最大值,且明顯低于LPS組(P<0.05),隨后開(kāi)始下降,在6h時(shí)降到正常值。內(nèi)毒素血癥Wista大鼠血清TNF-α變化詳細(xì)情況見(jiàn)表1。2.2心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)LPS組心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)在2h時(shí)達(dá)到最大值,且明顯高于生理鹽水對(duì)照組(P<0.05),隨后心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)開(kāi)始下降,并在4h,6h,12h,24h時(shí)均明顯高于生理鹽水對(duì)照組(P<0.05)。LPS+EPO組心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)在2h時(shí)達(dá)到最大值,且明顯低于LPS組(P<0.05),隨后開(kāi)始下降,并在4h、6h、12h、24h時(shí)均明顯低于LPS組(P<0.05)。內(nèi)毒素血癥Wistar大鼠心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)變化詳細(xì)情況見(jiàn)表2。2.3大鼠心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)與血清tnf-之間的相關(guān)性經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)單相關(guān)分析表明,內(nèi)毒素血癥Wistar大鼠心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)與血清TNF-α存在明顯的直線正相關(guān)性(r=0.7643,P<0.05,Y=457.58X-109.63)。3epo對(duì)心肌細(xì)胞凋亡的影響膿毒血癥是臨床上較多見(jiàn)的危重病,通常引起多器官功能的衰竭而導(dǎo)致患者死亡。膿毒血癥是學(xué)界公認(rèn)的導(dǎo)致重癥病人死亡的首要因素,特別是膿毒癥休克(sepsisshock)患者的死亡率達(dá)到46.5%。膿毒血癥的發(fā)生常常是由于細(xì)菌分泌的內(nèi)毒素釋放進(jìn)入血液內(nèi)毒素可使機(jī)體產(chǎn)生全身炎癥反應(yīng)綜合癥進(jìn)而損傷多器官臟器,尤其是導(dǎo)致血液循環(huán)紊亂及心功能衰竭。膿毒癥的發(fā)病機(jī)理十分復(fù)雜,涉及炎癥、感染、組織損傷及免疫等諸多方面,并關(guān)系到多器官病理生理的改變。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,內(nèi)毒素誘導(dǎo)的內(nèi)毒素血癥Wistar大鼠心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯高于生理鹽水對(duì)照組(P<0.05),表明膿毒癥可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡。內(nèi)毒素誘導(dǎo)的膿毒癥導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡的具體機(jī)理雖然還不十分清楚,但心肌細(xì)胞凋亡后心肌收縮力下降,會(huì)加速內(nèi)毒素對(duì)心肌的損傷進(jìn)程機(jī)體受到LPS刺激后,巨噬細(xì)胞會(huì)明顯上調(diào)TNFmRNA的表達(dá),進(jìn)而合成分泌TNF-α增加,可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡進(jìn)而損傷心臟功能,與心力衰竭的發(fā)生發(fā)展有密切聯(lián)系。TNF-α是活化T淋巴細(xì)胞及巨噬細(xì)胞分泌的免疫調(diào)節(jié)因子,其生物學(xué)活性十分廣泛。正常人血清中的TNF-α濃度較低,感染性休克或膿毒癥患者血清TNF-α濃度明顯增加EPO是人工克隆的生長(zhǎng)因子,通常用于治療貧血以促進(jìn)紅細(xì)胞的生成,在臨床上得到廣泛應(yīng)用已久。EPO造血活性的主要機(jī)理不是直接刺激紅細(xì)胞的產(chǎn)生,而是抑制晚紅系祖細(xì)胞的凋亡本組研究結(jié)果顯示,內(nèi)毒素血癥Wistar大鼠心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)與血清TNF-α存在明顯的直線正相關(guān)性(r=0.7643,P<0.05,Y=457.58X-109.63),表明TNF-α是參與內(nèi)毒素血癥大鼠心肌細(xì)胞凋亡的一個(gè)重要因素。進(jìn)一步研究結(jié)果顯示,LPS+EPO組TNF-α濃度在2h時(shí)達(dá)到最大值,且明顯低于LPS組(P<0.05),隨后開(kāi)始下降,在6h時(shí)降到正常值,表明外源性EPO可抑制TNF-α的產(chǎn)生。給予膿毒血癥大鼠外源性EPO可降低血清TNF-α的水平,從而降低心肌細(xì)胞凋亡指數(shù),延緩心肌細(xì)胞凋亡,改善大鼠心肌收縮力及心功能,降低