第一節(jié)普通毒性試驗一、急性毒性試驗(1)經(jīng)口或注射給藥急性毒性試驗(2)經(jīng)皮給藥急性毒性試驗目標：（1）求出受試物半數(shù)致死量（LD50）。（2）說明受試物急性毒性劑量-反應關系與中毒特征，為搶救治療辦法提供依據(jù)。（3）為受試物毒性作出初步判斷，為其它毒性試驗設計提供依據(jù)。1獸藥的毒理學試驗和安全性評價專家講座第1頁經(jīng)口或注射給藥急性毒性試驗1.動物小鼠（體重18～22g）、大鼠（體重180～200g）或其它敏感動物。應注明動物品系。每組小鼠不少于10只、大鼠不少于6只，雌雄各半，雌性應未產(chǎn)無孕。2.供試藥品配制普通用水為溶劑,將藥品配成一定濃度溶液.2獸藥的毒理學試驗和安全性評價專家講座第2頁

3.給藥方式與最大致積

灌胃法:一次最大灌胃量1.0ml/只(小鼠)4.0ml/只(大鼠)

腹腔注射:一次最大注射量1.0ml/只(小鼠)3.0ml/只(大鼠)4.劑量與分組預試驗全部致死最小劑量LD100和全部存活最大劑量LD0正式試驗5-7個劑量組,組間劑量呈等比級數(shù),其比值為1.2-1.4.3獸藥的毒理學試驗和安全性評價專家講座第3頁

5.觀察指標

動物普通健康情況，中毒表現(xiàn)和死亡過程。時間：7天。死亡動物：大致剖檢、病理組織學檢驗（必要時）6.LD50計算

寇氏法計算供試藥LD50值及其95%可信限范圍。7.結(jié)果判定

大鼠一次經(jīng)口LD50在1mg/kg以下為極毒，1～50mg/kg為劇毒，50～500mg/kg為中等毒，500～5000mg/kg為低毒，5000

mg/kg以上者為實際無毒。4獸藥的毒理學試驗和安全性評價專家講座第4頁小鼠腹腔注射敵百蟲LD50計算表

組別劑量(mg/kg)對數(shù)劑量(Xi)試驗動物數(shù)(ni)死亡動物數(shù)(ri)死亡率(pi)存活率(q)13002.47711000123602.55631020.20.834322.63551050.50.545182.71431070.70.356222.793810101.00累計---∑

ri24∑

Pi2.4∑q2.65獸藥的毒理學試驗和安全性評價專家講座第5頁

計算LD50，代入以下公式：

lgLD50=Xk-d（∑Pi–0.5)LD50=Lg–1[Xk-d（∑Pi–0.5)]式中Xk

為最大對數(shù)劑量,∑Pi為死亡率總和;d為相鄰兩組劑量比值對數(shù),d=lg1.2=0.0792則:LD50=Lg–1[2.7938-0.0792(2.4-0.5)]=Lg–12.6433=439.87(mg/kg)6獸藥的毒理學試驗和安全性評價專家講座第6頁經(jīng)皮給藥急性毒性試驗1.動物

選取健康家兔（2.0～3.0kg）、豚鼠(350～450g)或大鼠(200～300g)，每組動物不少于6只，雌雄各半。2.供試藥品配制供試藥品如是固體，應磨成細粉狀，過120目篩，并用適量水或無毒無刺激性賦型劑（橄欖油、羊毛脂、凡士林等）混勻。如為液體，普通不要稀釋。7獸藥的毒理學試驗和安全性評價專家講座第7頁

3.給藥方式

脫去動物背部脊柱兩側(cè)毛發(fā)（不得損傷皮膚），脫毛后二十四小時檢驗皮膚，如無損傷才能進行試驗。將供試藥物均勻地涂敷于脫毛區(qū)，不應少于動物體表面積10%，用塑料紙和兩層紗布覆蓋，再用膠布或繃帶固定，以防脫落和動物舔食。敷藥二十四小時。試驗結(jié)束后，用溫水或適當溶劑去除殘留供試藥。大鼠可采取浸尾方法給藥。8獸藥的毒理學試驗和安全性評價專家講座第8頁

4.劑量與分組

正式試驗前，用少許動物做預備試驗，依據(jù)24小時內(nèi)動物死亡情況，預計LD50可能范圍，以確定正式試驗劑量。普通分為4個劑量組，組間劑量呈等比級數(shù)。其比值為：1:1.5-3.0。若用賦形劑，需設賦形劑對照組。9獸藥的毒理學試驗和安全性評價專家講座第9頁5.觀察指標

觀察動物全身中毒表現(xiàn)和死亡情況，觀察時間為一周。若給藥4天后仍有動物死亡時，仍需繼續(xù)觀察一周，對死亡動物應做大致剖檢，必要時進行病理組織學檢驗。10獸藥的毒理學試驗和安全性評價專家講座第10頁

6.結(jié)果判定

兔涂皮LD50在5mg/kg以下為極毒，5～44mg/kg為劇毒，44～350mg/kg為中等毒，350～2180mg/kg為低毒，2180mg/kg以上者為實際無毒。11獸藥的毒理學試驗和安全性評價專家講座第11頁二、亞慢性毒性試驗確定外來化學物質(zhì)在動物1/10左右生命時間內(nèi)，重復屢次接觸后有沒有引發(fā)損害觀察過程。又稱短期試驗、亞急性毒性試驗（Subchronictoxicitytest）。

目標：1.毒性確定2.靶器官3.慢性毒性試驗依據(jù)12獸藥的毒理學試驗和安全性評價專家講座第12頁試驗方法1.動物

普通選取大鼠(100～200g)或小鼠(15～20g)。有條件時，采取供試藥品靶動物雞等。外購動物需喂養(yǎng)一周后才能供試驗用。13獸藥的毒理學試驗和安全性評價專家講座第13頁2.試驗周期

臨床用藥期（天）毒性試驗給藥期（天）1～314728309030天以上6個月14獸藥的毒理學試驗和安全性評價專家講座第14頁3.給藥方式

試驗周期給藥路徑14天大鼠、小鼠灌胃

雞

藥丸28天以上混飼自由采食飲水不限15獸藥的毒理學試驗和安全性評價專家講座第15頁4.劑量與分組

大鼠20只/組，雌雄各半對照組低劑量組高于有效量，不出現(xiàn)毒性反應中劑量組高劑量組部分動物出現(xiàn)毒性反應或死亡但死亡數(shù)不超出20%16獸藥的毒理學試驗和安全性評價專家講座第16頁5.觀察指標

分六大項，詳細指標為：（1）健康情況天天（2）體重，飼料消耗2-3次/周（3）血液學檢驗定時（4）血液生化學檢驗定時（5）肝、腎絕對重量和臟器指數(shù)試驗結(jié)束時（6）剖檢、組織病理學檢驗試驗結(jié)束時17獸藥的毒理學試驗和安全性評價專家講座第17頁6.結(jié)果處理

試驗數(shù)據(jù)方差分析或X2

病理改變照片寫出評價匯報18獸藥的毒理學試驗和安全性評價專家講座第18頁三、長久毒性試驗1.概念外來化學物質(zhì)在動物生命期大部分時間或終生接觸于機體時所引發(fā)損害作用，稱為長久毒性作用或慢性毒性作用。確定外來化學物質(zhì)這種慢性毒性作用動物試驗觀察方法，稱為長久毒性試驗。19獸藥的毒理學試驗和安全性評價專家講座第19頁2.目標觀察長久重復攝入低劑量受試物，可能對機體造成損害、嚴重程度、停藥后發(fā)展和恢復情況，為臨床試驗提供依據(jù)。3.試驗方法（1）動物

兩種動物（嚙齒類和非嚙齒類），當前要求用一個嚙齒類動物進行全方面系統(tǒng)試驗。20獸藥的毒理學試驗和安全性評價專家講座第20頁

（2）劑量分組

試驗組：4～5個，設高劑量組1～2個，中劑量組1～2個，低劑量組1～2個。

以LD501/10、1/50、1/100、1/1000劑量分組。對照組：1個（3）染毒方式混飼或飲水，由動物自由進食?；蛲坎疗つw。21獸藥的毒理學試驗和安全性評價專家講座第21頁（4）觀察指標普通情況：健康、生長發(fā)育、進食量，尤其是體重。生物化學指標：肝、腎功效。血液學改變：Hb，WBC，RBC，病理學檢驗：病了解剖和病理組織學改變。（5）結(jié)果評價參考亞急性毒性試驗。22獸藥的毒理學試驗和安全性評價專家講座第22頁第二節(jié)特殊毒性試驗致突變:

體外:（1）艾母氏(Ames)試驗(必做)（2）哺乳動物培養(yǎng)細胞染色體畸變（CHO、CHL）選做體內(nèi):（3）微核試驗(必做)（4）精子畸形試驗選做（5）小鼠睪丸精原細胞染色體畸變試驗選做（6）顯性致死試驗若（4）、（5）任一項為陽性，必做（6）23獸藥的毒理學試驗和安全性評價專家講座第23頁

致畸:（1）傳統(tǒng)致畸試驗(必做)普通獸藥必做（2）喂養(yǎng)繁殖毒性試驗（3）喂養(yǎng)致畸試驗（2）、（3）飼料藥品添加劑必須增做24獸藥的毒理學試驗和安全性評價專家講座第24頁一、艾母氏(Ames)試驗方法1.原理組氨酸缺點型（即突變型）鼠傷寒沙門氏菌在缺乏組氨酸培養(yǎng)基上不能生長，但在加有致突變原培養(yǎng)基上培養(yǎng)，則可使突變型產(chǎn)生回復突變成為野生型，即恢復合成組氨酸能力，于是就能在缺乏組氨酸培養(yǎng)基上生長，依據(jù)其生長菌落數(shù)量判斷受試物是否含有致突變性。25獸藥的毒理學試驗和安全性評價專家講座第25頁

野生型（能合成組氨酸）

缺乏組氨酸培養(yǎng)基加有致突變原培養(yǎng)基組氨酸缺點型（即突變型）鼠傷寒沙門氏菌。。。。。。

。26獸藥的毒理學試驗和安全性評價專家講座第26頁

2.菌種組氨酸營養(yǎng)缺點型鼠傷寒沙門氏菌TA97a、TA98、TA100、TA102四個標準株。3.劑量分組每次試驗要求4--5個劑量組，每個劑量做三個平行平皿。高劑量以不抑菌為標準。液態(tài)受試物：0.05-50ul/平皿固態(tài)受試物：0.1-1000ug/平皿，最高劑量可達5000ug/平皿。

選定后劑量藥品應配制成適當濃度體積：100ul或200ul/皿。27獸藥的毒理學試驗和安全性評價專家講座第27頁

4.溶劑水5.對照物每次檢測均需要陽性對照：已知陽性藥品陰性對照：溶劑

加S9混合液時要同時作不加S9混合液對照平皿6.S9混合液假如受試物可能是經(jīng)動物體酶系統(tǒng)活化代謝后才含有致突變作用，則試驗過程需要在培養(yǎng)基上同時加入哺乳動物肝微粒體（S9混合液），使受試物被活化而展現(xiàn)致突變作用。

28獸藥的毒理學試驗和安全性評價專家講座第28頁

S9制備

選體重200g左右成年雄性大鼠，經(jīng)誘導劑誘導后宰殺（處死前12小時禁食）。在低溫條件下，無菌操作取出肝臟，用KCI液淋洗后置勻漿器中制成勻漿。低溫離心后分裝，保留于液氮或–80℃冰箱。29獸藥的毒理學試驗和安全性評價專家講座第29頁

7.試驗步驟

TA97aTA98TA100TA10237℃水浴振蕩培養(yǎng)活菌數(shù)不得少于1～2x109/ml

增菌培養(yǎng)液增菌培養(yǎng)液增菌培養(yǎng)液增菌培養(yǎng)液30獸藥的毒理學試驗和安全性評價專家講座第30頁試驗步驟

受檢物+菌液+S9混合液或磷酸鹽緩（0.1-0.2ml）（0.1ml）（0.5ml）

37℃水浴振蕩培養(yǎng)20imns加入45℃頂層培養(yǎng)基2ml混勻37℃培養(yǎng)48h

無菌小試管含底層培養(yǎng)基平皿31獸藥的毒理學試驗和安全性評價專家講座第31頁8.結(jié)果評價

受試組菌落數(shù)大于2倍自發(fā)回變數(shù)，并有劑量反應關系和重現(xiàn)性，判為誘變陽性。32獸藥的毒理學試驗和安全性評價專家講座第32頁二、微核試驗

原理：骨髓細胞染色體經(jīng)誘變物作用，發(fā)生突變后出現(xiàn)斷裂，并有部分斷片在有絲分裂后期不移向兩極，在有絲分裂末期不進入分裂細胞核中，因而存留于細胞漿中，形成一個或幾個圓形至杏仁狀結(jié)構(gòu)，并存留一定時間。因為這種圓形結(jié)構(gòu)比普通細胞核小，故稱微核（micronucleus）。33獸藥的毒理學試驗和安全性評價專家講座第33頁圖示原理：

誘變物嗜多染紅細胞微核直徑相當于紅細胞直徑1/20～1/5。34獸藥的毒理學試驗和安全性評價專家講座第34頁

1.動物

成年健康小鼠（品系），隨機分為受試組和對照組。10只/組，雌雄各半。2.受試物處理將受試物溶于適宜溶劑中,以0.1-0.2ml/10g體重給藥體積配制成適當濃度。3.給藥方式給藥路徑：與臨床用藥路徑相同。內(nèi)服時需灌胃。給藥劑量：以LD50為依據(jù)，設三個劑量組。高劑量組LD500.8-0.5；低劑量組LD500.05-0.1

并設陰性對照和陽性對照組，陽性對照物可選取已知能誘發(fā)微核陽性誘變劑。35獸藥的毒理學試驗和安全性評價專家講座第35頁

4.試驗操作

一次給藥：24，48，72小時取樣制片。

二次給藥：第二次給藥后6，二十四小時取樣制片。處死小鼠，將股骨骨髓洗入離心管，離心，常規(guī)涂片。姬姆薩染色，鏡檢。5.鏡檢計數(shù)：1000個嗜多染紅細胞（PCE）/片求出：嗜多染紅細胞/正染紅細胞（NCE）必要時，丫啶橙染色，熒光顯微鏡分析計數(shù)。36獸藥的毒理學試驗和安全性評價專家講座第36頁

6.結(jié)果評價

將數(shù)據(jù)列表，分別列出嗜多染紅細胞數(shù)，微核數(shù)及PCE/NCE之比。所得結(jié)果用t檢驗進行數(shù)據(jù)分析，經(jīng)重復試驗P<0.01并有劑量反應關系時，判為陽性。37獸藥的毒理學試驗和安全性評價專家講座第37頁三、異常毒性檢驗

（一）目標

將一定劑量供試品溶液注入小鼠體內(nèi)或口服給藥，在要求時間內(nèi)觀察小鼠死亡情況，以判定供試品是否符合要求一種方法。

38獸藥的毒理學試驗和安全性評價專家講座第38頁

（二）試驗動物

小鼠健康無傷，體重17～20g。做過本試驗小鼠不能重復使用。39獸藥的毒理學試驗和安全性評價專家講座第39頁（三）檢驗方法

取5只小鼠，按藥品給藥路徑，每只小鼠分別給予供試品溶液0.5ml。靜脈注射：尾靜脈注入供試品溶液，注射時間普通為4～5秒，要求遲緩注射藥品可延長至30秒。皮下注射：可見注射部位皮下出現(xiàn)泡狀隆起。40獸藥的毒理學試驗和安全性評價專家講座第40頁（四）結(jié)果判定

除另有要求外，5只小鼠在給藥后48小時內(nèi)不得死亡。如有死亡，另取體重17～20g小鼠10只復測，全部小鼠在48小時內(nèi)不得有死亡，不然，判為不合格。41獸藥的毒理學試驗和安全性評價專家講座第41頁第三節(jié)制劑安全性評價一、熱原反應試驗二、溶血性檢驗三、局部刺激性試驗1.家兔點眼法2.家兔股四頭肌法四、過敏性試驗五、降壓物質(zhì)檢驗42獸藥的毒理學試驗和安全性評價專家講座第42頁一、熱原反應試驗1.概念是指一些微生物尸體及其增殖時產(chǎn)物,主要是細菌一個內(nèi)毒素。大多數(shù)細菌都能在增殖時產(chǎn)生熱原，霉菌與酵母菌也能產(chǎn)生熱原。熱原隨注射液進入動物體后，輕則能引發(fā)體溫升高，嚴重虛脫死亡。43獸藥的毒理學試驗和安全性評價專家講座第43頁

檢驗對象：注射用原料溶媒注射液注射器44獸藥的毒理學試驗和安全性評價專家講座第44頁注射劑熱原污染路徑1.溶媒注射用水2.原料適宜微生物生長、生物制品

如葡萄糖、水解蛋白、氯化鈉

3.用具或容器污染4.生產(chǎn)過程中污染及時滅菌，縮短時間45獸藥的毒理學試驗和安全性評價專家講座第45頁熱原性質(zhì)1.耐熱性

60℃1小時不受影響;180-200℃干熱2小時或250℃30mins徹底破壞2.濾過性過細菌濾器;不能過透析膜3.水溶性

不溶于有機溶媒4.不揮發(fā)性但可隨水蒸氣帶入蒸餾水5.被吸附性

活性炭,硅藻土,樹脂等46獸藥的毒理學試驗和安全性評價專家講座第46頁除去熱原方法1.預防污染

藥液、溶媒（二十四小時內(nèi)ddH2O）2.去除熱原

容器用強酸、強堿、干熱3.吸附

0.1-0.2%活性炭；多層石棉板4.超聲波破壞熱原5.氧化劑

高錳酸鉀、雙氧水47獸藥的毒理學試驗和安全性評價專家講座第47頁2.熱原檢驗法本法系將一定劑量供試品，靜脈注射入家兔體內(nèi)，在要求時間內(nèi)，觀察家兔體溫升高情況，以判定供試品中所含熱原程度是否符合要求。48獸藥的毒理學試驗和安全性評價專家講座第48頁(1)選符合要求家兔1.健康無傷，體重1.7～3.0kg，同一起源、同一品系，雌兔無孕。2.1兔1籠，標兔號，經(jīng)7日同一喂養(yǎng)條件喂養(yǎng)，測溫條件相同。在此期間，體重應不減輕，精神、食欲、排泄等不得有異常。49獸藥的毒理學試驗和安全性評價專家講座第49頁(2)試驗前準備1、試驗前1～2日，供試用家兔應處于同一溫度環(huán)境中，試驗室與喂養(yǎng)室環(huán)境溫度相差不得大于5℃。50獸藥的毒理學試驗和安全性評價專家講座第50頁2.室溫應在17～28℃，在試驗全部過程中，應注意室溫改變不得大于3℃，應防止噪音干擾。3.家兔在試驗前停食1小時并置于固定盒內(nèi)，直至試驗完成。51獸藥的毒理學試驗和安全性評價專家講座第51頁4、肛溫計插入深度約6cm，不得少于1.5分鐘，每隔30分鐘測量體溫1次，普通測量2次，兩次體溫之差不得超出0.2℃，以此兩次體溫平均值作為該兔正常體溫。52獸藥的毒理學試驗和安全性評價專家講座第52頁

5.試驗用注射器、針頭及一切與供試品溶液接觸器皿，應置烘箱中用250℃加熱30分鐘或用180℃加熱2小時，也可用其它適宜方法除去熱原。53獸藥的毒理學試驗和安全性評價專家講座第53頁(3)檢驗方法1.每個供試樣品用家兔3只，在測定正常體溫(38.3-39.6℃)后15分鐘內(nèi)給藥。2.供試品注射體積，按家兔體重不少于1ml/kg，小于10ml/kg，體積在5～10ml/kg溶液應在37～38℃預熱后注射。54獸藥的毒理學試驗和安全性評價專家講座第54頁3.耳靜脈遲緩注射，但每兔不超出3分鐘。4.給藥后每隔30分鐘測溫1次，共測6次。55獸藥的毒理學試驗和安全性評價專家講座第55頁5、溫差計算：（1）以6次體溫中最高一次減去正常體溫，即為該兔體溫升高溫度。（2）以6次體溫中最低一次減去正常體溫，即為該兔體溫降低溫度。56獸藥的毒理學試驗和安全性評價專家講座第56頁(4)結(jié)果判斷1.判斷復試：（1）初試3只兔中僅有1只體溫升高0.6℃或0.6℃以上，或3只家兔升溫均低于0.6℃，但升溫總數(shù)達1.4℃或1.4℃以上,應另取5只家兔復試。57獸藥的毒理學試驗和安全性評價專家講座第57頁（2）含有熱原供試品，普通在給家兔靜脈注射后1~2小時出現(xiàn)升溫高峰，當?shù)?小時升溫大于0.6℃時，宜復試后再作判斷。（3）3只家兔中有1只降溫值小于0.6℃，或3只家兔中有2只降溫值在0.45~0.55℃，應另取3只家兔復試。58獸藥的毒理學試驗和安全性評價專家講座第58頁2.判斷合格（1）初試3只家兔中，體溫升高0.6℃以下，而且3只家兔升溫總數(shù)在1.4℃以下可判斷為符合要求。59獸藥的毒理學試驗和安全性評價專家講座第59頁（2）復試5只家兔中，體溫升高0.6℃或0.6℃以上家兔數(shù)僅有1只，而且初復試合并，8只家兔升溫總數(shù)為3.5℃或3.5℃以下，可判斷為符合要求。

60獸藥的毒理學試驗和安全性評價專家講座第60頁3、判斷不合格（1）初試3只家兔中，體溫升高0.6℃或0.6℃以上家兔數(shù)有2只或3只，可判斷為不符合要求。61獸藥的毒理學試驗和安全性評價專家講座第61頁（2）復試5只家兔中，體溫升高0.6℃或0.6℃以上家兔數(shù)有2只或2只以上，可判斷為不符合要求。（3）初復試合并8只家兔升溫總數(shù)超出3.5℃，可判斷為不符合要求。62獸藥的毒理學試驗和安全性評價專家講座第62頁

二、中草藥注射劑質(zhì)量檢驗1.急性毒性

中草藥注射劑耐受量應為家畜臨床用量100倍為安全，60倍以上者可慎用。63獸藥的毒理學試驗和安全性評價專家講座第63頁詳細方法取小鼠5只，尾靜脈或腹腔注射0.5ml藥液，觀察小鼠有沒有震顫、驚厥、四肢癱瘓、步態(tài)不穩(wěn)、豎毛、呼吸抑制或死亡等反應。普通觀察48-72小時，如有死亡，應另取10只重做，不得有死亡。64獸藥的毒理學試驗和安全性評價專家講座第64頁2、溶血試驗含皂苷或鞣質(zhì)或成份還未十分明確中草藥注射液必須做溶血試驗。65獸藥的毒理學試驗和安全性評價專家講座第65頁詳細方法（1）2%兔紅細胞生理鹽水配制

兔耳緣靜脈采血1ml，置青霉素小瓶（西林瓶）中，加玻璃珠攪拌除纖維蛋白，用生理鹽水離心洗滌至上清液澄清為止，然后配成2%混懸液。

66獸藥的毒理學試驗和安全性評價專家講座第66頁（2）溶血試驗設計表試管號1234567被試藥液（ml）0.10.20.30.40.500生理鹽水（ml）2.42.32.22.12.02.50紅細胞液（ml）2.52.52.52.52.52.52.5蒸餾水（ml）0000002.567獸藥的毒理學試驗和安全性評價專家講座第67頁

取潔凈試管7支，按上表排列加入各種溶液，第6管為陰性對照管，第7管為陽性對照管。各管輕輕搖勻后，37℃恒溫箱或水浴中保溫（或25-37℃室溫下），開始每隔15分鐘，1小時后每隔1小時分別觀察1次，共3小時。68獸藥的毒理學試驗和安全性評價專家講座第68頁（3）結(jié)果判斷判定標準:1.全溶血:溶液澄明紅色,管底無紅細胞殘留.2.部分溶血:溶液澄明紅色或棕色,管底有少許紅細胞殘留.3.無溶血:紅細胞全部下沉,上層液體無色澄明.4.凝集:雖不溶血,但出現(xiàn)紅絮狀物,振搖后不能分散.將凝集物置于載玻片上,蓋上蓋玻片,從邊緣滴加生理鹽水,顯微鏡下觀察,紅細胞散開者為假凝集,反之為真凝集.69獸藥的毒理學試驗和安全性評價專家講座第69頁

結(jié)果判定:普通認為,第3管或第3管以前被試藥液在30分鐘內(nèi)引起溶血、部分溶血或出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，不宜作靜脈注射用；不溶血或出現(xiàn)假凝集現(xiàn)象才可作注射用。70獸藥的毒理學試驗和安全性評價專家講座第70頁