多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerasechainreaction,PCR技術(shù))，是一種在體外快速擴(kuò)增特定基因或DNA序列的方法，故又稱為DNA體外擴(kuò)增技術(shù)。課題2多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段脫氧核糖含氮堿基磷酸AGCT1、DNA的基本單位－脫氧核苷酸一、DNA分子的結(jié)構(gòu)12345O鳥(niǎo)嘌呤脫氧核苷酸胞嘧啶脫氧核苷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸2、脫氧核苷酸的種類A腺嘌呤脫氧核苷酸GCTATGCAGCT3、DNA分子的平面結(jié)構(gòu)氫鍵5'端3'端5'端3'端4、DNA的立體結(jié)構(gòu)

——雙螺旋結(jié)構(gòu)2、時(shí)間：細(xì)胞分裂間期（有絲分裂間期，減數(shù)第一次分裂的間期）1、概念：以親代DNA為模板，依據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)合成子代在DNA的過(guò)程。3、場(chǎng)所：主要是細(xì)胞核（其次是線粒體、葉綠體）二．細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制的過(guò)程4、條件：①模板：親代DNA的兩條母鏈②原料：游離的四種脫氧核苷酸③能量：ATP④

酶：解旋酶、DNA聚合酶⑤引物：一小段RNA，能與DNA母鏈的一段堿基序列互補(bǔ)配對(duì)5、過(guò)程（1）解旋：解旋酶、ATP（2）以DNA的兩條母鏈為模板，依據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)規(guī)章，合成子鏈。（3）子鏈、母鏈螺旋構(gòu)成子代DNADNA體內(nèi)復(fù)制（示意）6、復(fù)制特點(diǎn)半保留復(fù)制，邊解旋邊復(fù)制，多起點(diǎn)復(fù)制。7、DNA復(fù)制的方向DNA的合成方向總是從子鏈的5’端向3’端延長(zhǎng)條件組分作用模板DNA的兩條單鏈供應(yīng)復(fù)制的模板原料四種脫氧核苷酸合成DNA子鏈的原料酶解旋酶TaqDNA聚合酶不需要催化合成DNA子鏈能量ATP不需要引物一般是一小段DNA使DNA聚合酶能夠從引物的3’端開(kāi)頭連接脫氧核苷酸

1、PCR的技術(shù)（DNA體外復(fù)制）的條件DNA雙鏈單鏈變性（加熱80-100℃

）復(fù)性（緩慢冷卻）一、PCR的原理（PCR的技術(shù)原理）一、PCR的原理（PCR的技術(shù)原理）1234522557294時(shí)間（min）溫度（℃）適溫延長(zhǎng)高溫變性低溫復(fù)性重復(fù)1~3步30輪3、DNA復(fù)制的方向DNA的合成方向總是從子鏈的5’端向3’端延長(zhǎng)2、步驟：變性——復(fù)性——延長(zhǎng)PCR技術(shù)的原理總結(jié)利用DNA分子的熱變性原理，通過(guò)掌握溫度來(lái)掌握雙鏈的解旋與結(jié)合，從而完成體外DAN分子的擴(kuò)增。體外DNA復(fù)制的條件：

四種脫氧核苷酸、耐高溫的DNA聚合酶、引物、模板；緩沖溶液和嚴(yán)格掌握溫度的溫控設(shè)備。復(fù)制的方向：子鏈的5’端向3’端延長(zhǎng)。二、PCR的反應(yīng)過(guò)程5/3/3/5/5/3/引物Ⅰ5/3/引物Ⅱ變性95oC復(fù)性55oC延伸72oC5/3/3/5/5

引物15

引物2第二次復(fù)制第一次復(fù)制5

5

5

5

5

5

模板DNA5

5

5

5

5

5

5

5

25～30次循環(huán)（復(fù)制）后，模板DNA的含量可以擴(kuò)大100萬(wàn)（220）倍以上。每個(gè)循環(huán)包括：變性——復(fù)性——延長(zhǎng)從其次輪循環(huán)開(kāi)頭，上一次循環(huán)的產(chǎn)物也可以作為模板參加反應(yīng)，并且由引物Ⅰ延長(zhǎng)而成的DNA單鏈會(huì)與引物Ⅱ結(jié)合，進(jìn)行DNA的延長(zhǎng)，這樣，DNA聚合酶只能特異性地復(fù)制處于兩個(gè)引物之間的DNA序列，使這段固定長(zhǎng)度的序列呈指數(shù)擴(kuò)增。PCR的反應(yīng)過(guò)程總結(jié)三、PCR反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)操作1、PCR儀設(shè)備及用具2、微量離心管一種薄壁塑料管，總?cè)莘e為0.5ml3、微量移液器用于定量轉(zhuǎn)移PCR配方中的液體，其上的一次性吸液槍頭用一次更換一次實(shí)質(zhì)上一臺(tái)能夠自動(dòng)調(diào)控溫度的儀器三、PCR反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)操作（1）按配方將所需試劑擺放在實(shí)驗(yàn)桌上（籌備）（2）用微量移液器按配方在微量離心管中依次加入各組分（移液）（3）蓋嚴(yán)離心管口的蓋子，用手指輕輕彈擊管壁（混合）（4）將微量離心管放在離心機(jī)上（離心）（5）將離心管放入PCR儀上，設(shè)置好PCR儀的循環(huán)程序（反應(yīng)）循環(huán)數(shù)變性復(fù)性延長(zhǎng)第一次94°C,10min－－30次９4℃，30s55℃，30s72℃，1min最后一次９4℃，1min55℃，30s72℃，1min四、結(jié)果分析與評(píng)價(jià)DNA含量的測(cè)定：稀釋→對(duì)比調(diào)零→測(cè)定→計(jì)算（公式見(jiàn)P63）波長(zhǎng)260nm處讀數(shù)蒸餾水做對(duì)比50倍（一）理論上DNA擴(kuò)增數(shù)目的計(jì)算四、課題成果評(píng)價(jià)1、一條DNA，復(fù)制n次，DNA為2n2、

a條DNA，復(fù)制n次，DNA為ax2n（二）實(shí)驗(yàn)中DNA含量的測(cè)定1、原理可以通過(guò)測(cè)量DNA含量來(lái)評(píng)價(jià)擴(kuò)增的效果，DNA在260nm的紫外線波段有一強(qiáng)烈的汲取峰，峰值的大小與DNA的含量有關(guān)2、過(guò)程①稀釋2μL

PCR反應(yīng)液，加入98μL蒸餾水，即將樣品進(jìn)行50倍稀釋②對(duì)比調(diào)零以蒸餾水作為空白對(duì)比，在波長(zhǎng)260nm處，將紫外分光光度計(jì)的讀數(shù)調(diào)節(jié)至零取DNA稀釋液100μL至比色杯中，測(cè)定260nm處的光汲取值③測(cè)定并計(jì)算DNA含量（

g/mL）＝50×(260nm的讀數(shù))×稀釋倍數(shù)50：在厚度為1cm比色杯中的吸光值為1,DNA

的含量為50g/ml的體內(nèi)DNA復(fù)制與PCR的技術(shù)區(qū)分：體內(nèi)復(fù)制PCR技術(shù)解旋在解旋酶作用下，細(xì)胞供應(yīng)ATP，部分解開(kāi)加熱到94oC,雙鏈全部解開(kāi)，不需解旋酶引物一小段RNA一般用DNA片段DNA聚合酶細(xì)胞自身的DNA聚合酶（不耐高溫）TaqDNA聚合酶復(fù)制特點(diǎn)半保留復(fù)制，邊解旋邊復(fù)制，多起點(diǎn)復(fù)制。半保留復(fù)制，完全解旋后復(fù)制，從模板鏈的一端開(kāi)頭復(fù)制。復(fù)制的方向子鏈的5’端向3’端延長(zhǎng)子鏈的5’端向3’端延長(zhǎng)課堂小結(jié)多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段PCR原理DNA的復(fù)制需要酶、原料、能量、引物DNA的變性和復(fù)性受溫度影響PCR過(guò)程變性復(fù)性延伸操作步驟配制PCR反應(yīng)體系移入離心管放入PCR儀設(shè)置工作參數(shù)DNA擴(kuò)增測(cè)定含量稀釋調(diào)零測(cè)定并讀數(shù)計(jì)算練習(xí)鞏固1、關(guān)于PCR技術(shù)的應(yīng)用，錯(cuò)誤的一項(xiàng)是A古生物學(xué)、刑偵破案、DNA序列測(cè)定B診斷遺傳疾病、基因克隆、古生物學(xué)CDNA序列測(cè)定、基因克隆、刑偵破案‘D診斷遺傳疾病、合成核苷酸、DNA序列測(cè)定2、DNA的合成方向總是從子鏈的哪一端向哪一端延長(zhǎng)？3、PCR技術(shù)最突出的優(yōu)點(diǎn)是A原理簡(jiǎn)潔B原料易找CTaqDNA聚合酶有耐熱性D快速、高效、靈敏、易于操作從子鏈的5’端向3’端延長(zhǎng)4、做PCR使用的微量離心管、槍頭、緩沖液及蒸餾水使用前必須進(jìn)行的關(guān)鍵步驟是A反復(fù)洗滌