羅氏沼蝦淀粉酶基因克隆及其表達(dá)分析

0東南亞umrandiii研究意義上：羅氏沼氣蝦產(chǎn)于東南亞國家。由于其生長速度快、口感好、肉長得、不必要的特點(diǎn)，已成為中國重要的淡水養(yǎng)殖品種之一。1材料和方法1.1資料采集和分析5月齡羅氏沼蝦由廣西南寧國家級羅氏沼蝦良種場提供。以肝胰腺為素材，進(jìn)行AMY基因克?。环謩e選取7尾雌/雄羅氏沼蝦采集樣品，包括腹神經(jīng)節(jié)、胃、心臟、鰓組織、性腺、肝胰腺、肌肉和腸道共8個組織，用于AMY基因表達(dá)分析；同時采集生長快速家系（FG）和生長慢速家系（SG）中體重和體長極端性狀的雌性羅氏沼蝦肌肉組織（1.2rna濃度和完整性檢測采用TRIzol提取羅氏沼蝦樣品總RNA，利用NanoDrop2000和1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA濃度及其完整性，再以PrimeScript1.3知識產(chǎn)權(quán)pcr擴(kuò)增根據(jù)GenBank已公布的羅氏沼蝦AMY基因EST序列（KM886337.1），利用AMY-1引物擴(kuò)增AMY基因CDS序列，PCR反應(yīng)體系15.0μL:2×TaqMasterMix7.5μL，上、下游引物各0.5μL,cDNA模板1.0μL,RNase-freeddH1.4親/疏水性及結(jié)構(gòu)預(yù)測利用ExPASyProtParam(/protparam/）分析羅氏沼蝦AMY基因編碼蛋白理化性質(zhì)；采用ExPASyProtScale(/protscale/）進(jìn)行親/疏水性預(yù)測；運(yùn)用SignalP-5.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）預(yù)測其信號肽；使用SMART(http://smart.embl.de/）進(jìn)行結(jié)構(gòu)域預(yù)測；利用MLRC(https://npsa-prabi.ibcp.fr/NPSA/npsa＿mlrc.html）和SWISS-MODEL(/）分別進(jìn)行編碼蛋白的二、三級結(jié)構(gòu)預(yù)測；并以DNASTAR中的MegAlign和Lasergenev8.0分別進(jìn)行同源比對及系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹分析。1.5所見的人類基因的發(fā)現(xiàn)分析基于克隆獲得的AMY基因CDS序列，以18SrRNA序列（DQ642856.1）為內(nèi)參基因（2結(jié)果與分析2.1李氏沼蝦amy基因cds序列及測序結(jié)果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果獲得1條明亮清晰、大小約2000bp的特異性條帶（圖1），與預(yù)期結(jié)果相符。測序結(jié)果顯示，羅氏沼蝦AMY基因CDS序列全長2121bp，共編碼706個氨基酸殘基；氨基酸序列比對分析發(fā)現(xiàn)其與NCBI已發(fā)布羅氏沼蝦（GenBank登錄號KM886337.1）相應(yīng)氨基酸序列的相似性達(dá)99.9%，僅是第251位堿基由A→G，導(dǎo)致第84位酪氨酸（Tyr）突變?yōu)榘腚装彼幔–ys）（圖2）。2.2羅氏沼蝦amy蛋白親水性及結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果羅氏沼蝦AMY基因編碼蛋白分子量為76.87kD，理論等電點(diǎn)（pI）為4.63。羅氏沼蝦AMY蛋白的甘氨酸（Gly）含量較高，占總氨基酸數(shù)的12.60%；帶正電荷的氨基酸殘基（Arg+Lys）為83個，帶負(fù)電荷的氨基酸殘基（Asp+Glu）為42個，不穩(wěn)定系數(shù)為33.17（屬于不穩(wěn)定蛋白），脂肪數(shù)為59.80;AMY蛋白親水性平均值為-0.398，具有較強(qiáng)的親水性（圖3），與ExPASyProtParam預(yù)測得到的親水性平均系數(shù)（GRAVY=-0.398）一致，故推測羅氏沼蝦AMY蛋白為不穩(wěn)定的親水性蛋白。SMART的結(jié)構(gòu)域預(yù)測結(jié)果表明，羅氏沼蝦AMY蛋白存在信號肽，且信號肽是由AWA-YD組成，其剪切位點(diǎn)分別在第18位和第19位氨基酸殘基間。羅氏沼蝦AMY蛋白還包含2個典型的淀粉酶結(jié)構(gòu)域，即domainA(2.3生磷酸化位點(diǎn)及氨基酸位點(diǎn)分析羅氏沼蝦AMY蛋白不存在糖基化位點(diǎn)；其磷酸化位點(diǎn)預(yù)測結(jié)果（圖4）顯示，在AMY肽鏈中可能發(fā)生磷酸化且分值在0.5以上的氨基酸位點(diǎn)有80個，其中，蘇氨酸（Thr）磷酸化位點(diǎn)29個，絲氨酸（Ser）磷酸化位點(diǎn)37個，酪氨酸（Tyr）磷酸化位點(diǎn)14個。由于AMY肽鏈?zhǔn)且越z氨酸磷酸化位點(diǎn)為主，故推測羅氏沼蝦AMY蛋白是以絲氨酸為主、蘇氨酸為輔的磷酸化修飾調(diào)控其生物功能。2.4卷/鏈-延伸鏈占比羅氏沼蝦AMY蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果（圖5）顯示，以無規(guī)則卷曲占比最高（占64.73%），其次是延伸鏈（占21.39%），α-螺旋僅占13.88%。利用SWISS-MODEL預(yù)測羅氏沼蝦AMY蛋白可能存在的三級結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖6所示。2.5資料同源性比對分析根據(jù)NCBI已公布的AMY基因EST序列，可知羅氏沼蝦AMY基因CDS序列編碼706個氨基酸殘基。針對羅氏沼蝦（AKL71614.1）、斑節(jié)對蝦（AME17649.1）、凡納濱對蝦（AIJ02079.1）、太平洋牡蠣（CAA69658.1）、褐蝦（AWU67110）、合浦珠母貝（AGN55419.1）、克氏原螯蝦（AXC43909.1）、大珠母貝（AEI58897.1）及中華絨螯蟹（ANG56301.1）的AMY氨基酸序列進(jìn)行同源比對分析，結(jié)果（圖7）顯示，羅氏沼蝦與克氏原螯蝦的相似性最高（62.6%），與大珠母貝的相似性較低（48.9%）?；贏MY氨基酸序列相似性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹（圖8）顯示，羅氏沼蝦與克氏原螯蝦的親緣關(guān)系最近，而與中華絨螯蟹的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。2.6相對表達(dá)量如圖9所示，AMY基因在雄性羅氏沼蝦不同組織中的相對表達(dá)量以肝胰腺最高，其次是胃，鰓組織的相對表達(dá)量最低；在雌性羅氏沼蝦中以肝胰腺的相對表達(dá)量最高，其次是胃，而肌肉的相對表達(dá)量最低。對比相同組織不同性別個體的AMY基因相對表達(dá)量發(fā)現(xiàn)，羅氏沼蝦AMY基因在雌性個體腸道中的相對表達(dá)量極顯著高于雄性個體（P<0.01，下同），鰓組織中的相對表達(dá)量顯著高于雄性個體（P<0.05），肝胰腺中的相對表達(dá)量極顯著低于雄性個體，而腹神經(jīng)節(jié)、胃、心臟、性腺和肌肉中的相對表達(dá)量差異不顯著（P>0.05）?？梢?，AMY基因在羅氏沼蝦不同組織中廣泛表達(dá)，但存在性別差異性和組織特異性。2.7等生長性狀表型值差異為探究羅氏沼蝦AMY基因在不同生長速度家系個體中的表達(dá)規(guī)律，以體重和體長等生長性狀表型值差異極顯著的FG和SG個體為供試材料，實(shí)時熒光定量PCR檢測不同生長速度家系個體肌肉中的AMY基因表達(dá)情況。由圖10可知，羅氏沼蝦AMY基因在FG個體肌肉中的相對表達(dá)量極顯著高于SG個體的相對表達(dá)量。3腸道組織中肝胰腺組織中的相對表達(dá)AMY是甲殼類動物體內(nèi)主要的消化酶類，對其新陳代謝及生長發(fā)育等活動發(fā)揮著極其重要的作用（本研究對羅氏沼蝦AMY基因的組織表達(dá)差異進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)AMY基因在羅氏沼蝦不同組織中廣泛表達(dá)，但存在性別差異性和組織特異性，具體表現(xiàn)為：雌性個體腸道中的相對表達(dá)量極顯著高于雄性個體，鰓組織中的相對表達(dá)量顯著高于雄性個體，而肝胰腺中的相對表達(dá)量極顯著低于雄性個體。AMY基因在雄性羅氏沼蝦不同組織中的相對表達(dá)量排序?yàn)楦我认?gt;胃>腹部神經(jīng)>腸道>精巢>心臟>肌肉>鰓組織，在雌性羅氏沼蝦中則表現(xiàn)為肝胰腺>胃>腸道>卵巢>腹神經(jīng)節(jié)>心臟>鰓組織