高效液相色譜-高分辨飛行時(shí)間質(zhì)譜快速鑒別小柴胡湯中的化學(xué)成分

小柴胡湯是東漢張仲景的經(jīng)典方劑。它是中醫(yī)和邵陽(yáng)的經(jīng)典方劑。它由柴胡、黃甘草、生姜和棗中的七味藥物組成。現(xiàn)代藥理研究表明,小柴胡湯具有抗癌、抗炎、防護(hù)肝纖維化患者向肝癌惡化等具有藥理作用。小柴胡湯中七味中藥所含化學(xué)成分不同,其中柴胡、人參、甘草主要成分為皂苷類(lèi)化合物,黃芩、甘草中主要成分為黃酮類(lèi)化合物,半夏中的化學(xué)成分包括生物堿、有機(jī)酸等?，F(xiàn)代研究證明,藥材中所含化學(xué)成分具有不同的藥理作用,如柴胡中皂苷類(lèi)成分具有抗病毒、抗腫瘤、抗炎等作用,人參中皂苷類(lèi)成分對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、免疫系統(tǒng)等具有藥理作用,黃芩中黃酮類(lèi)成分具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等作用。因此,對(duì)藥材中化學(xué)成分進(jìn)行快速分析鑒別與色譜表征,對(duì)于進(jìn)一步的中藥化學(xué)成分代謝與作用機(jī)制研究具有重要意義?，F(xiàn)代分析技術(shù)的發(fā)展,特別是液質(zhì)聯(lián)用分析技術(shù)為中藥化學(xué)成分的分析鑒別提供了簡(jiǎn)便準(zhǔn)確可靠的方法。高分辨飛行時(shí)間質(zhì)譜是一種新興且發(fā)展比較迅速的質(zhì)譜技術(shù),其具有檢測(cè)靈敏度高,測(cè)定化合物質(zhì)荷比精確、離子掃描范圍寬、擴(kuò)大掃描范圍不損失檢測(cè)靈敏度的優(yōu)點(diǎn),現(xiàn)已廣泛用于中藥及生物樣品的分離分析。因此,采用高效液相色譜-高分辨飛行時(shí)間質(zhì)譜(HPLC-TOF/MS)方法可以在線(xiàn)獲取分析樣品中各化合物離子的精確質(zhì)荷比,對(duì)比自建化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù),可迅速對(duì)中藥復(fù)方中化學(xué)成分進(jìn)行快速分析鑒別。目前對(duì)小柴胡湯中化學(xué)成分鑒別與含量測(cè)定方面的研究多有報(bào)道[13,14,15,16,17,18,19,20],但多以其中單味藥材中個(gè)別成分為指標(biāo)進(jìn)行含量測(cè)定,這顯然不能滿(mǎn)足中藥多成分分析的要求。本研究采用HPLC-TOF/MS技術(shù)對(duì)小柴胡湯中的化學(xué)成分進(jìn)行了快速分析鑒別,借助數(shù)據(jù)庫(kù)自動(dòng)匹配,一次性鑒別出小柴胡湯中38個(gè)化學(xué)成分。1材料和方法1.1色譜純度、標(biāo)準(zhǔn)1100型液相色譜儀,包括在線(xiàn)脫氣機(jī)、四元泵、高性能自動(dòng)進(jìn)樣器;AgilentG1969A飛行時(shí)間質(zhì)譜儀,配有標(biāo)準(zhǔn)電噴霧離子源(ESI)、MassHunter色譜工作站和QualitativeAnalysis質(zhì)譜分析軟件。甘草苷、黃芩苷、漢黃芩苷、人參皂苷Rg1、甘草酸單銨鹽對(duì)照品購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所,純度>99.0%。甲醇、甲酸均為色譜純。甲醇購(gòu)自美國(guó)Fisher公司,水為娃哈哈純凈水。藥材及飲片均經(jīng)第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)教研室孫蓮娜副教授鑒定,柴胡(BupleurumscorzonerifoliumWilld.的干燥根,批號(hào):PD060707,產(chǎn)地:內(nèi)蒙古),黃芩(ScutellariabaicalensisGeorgi.的干燥根加工品,批號(hào):HY2006030204,產(chǎn)地:河北),炙甘草(GlycyrrhizauralensisFisch.的干燥根及根莖加工品,批號(hào):XD060826,產(chǎn)地:新疆),人參(PanaxginsengC.A.Mey.的干燥根及根莖,批號(hào):071224,產(chǎn)地:遼寧),制半夏[Pinelliaternate(Thunb.)Breit.的干燥塊莖加工品,批號(hào):060914,產(chǎn)地:四川],生姜(ZingiberofficinaleRosc.的新鮮根莖,產(chǎn)地:上海),大棗(ZiziphusjujubaMill.的干燥成熟果實(shí),批號(hào):HP2006070501,產(chǎn)地:山東)。1.2樣品制備1.2.1制備天麻生姜湯分別取飲片柴胡125g、黃芩46.9g、炙甘草46.9g、人參46.9g、制半夏50g、生姜46.9g、大棗12枚,加水2400ml,文火煮沸至1200ml。四層紗布濾去藥渣,濾液濃縮至600ml。生藥/水約為0.6g/ml,1ml藥液用5ml純凈水稀釋。進(jìn)樣前,樣品經(jīng)過(guò)0.22μm微孔濾膜過(guò)濾。1.2.2對(duì)照品儲(chǔ)備液的制備分別精密稱(chēng)取5個(gè)成分的對(duì)照品:甘草苷8.0mg、黃芩苷8.5mg、漢黃芩苷15.4mg、人參皂苷Rg113.8mg、甘草酸單銨鹽8.0mg分別置于100ml量瓶中,用甲醇溶解并定容,配成濃度(μg/ml)分別為甘草苷80、黃芩苷85、漢黃芩苷154、人參皂苷Rg1138、甘草酸單銨鹽80的對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密量取上述配制好的對(duì)照品儲(chǔ)備液甘草苷1ml、黃芩苷1ml、漢黃芩苷0.5ml、人參皂苷Rg10.5ml、甘草酸單銨鹽1ml置于5ml量瓶中,加甲醇定容至刻度,即得對(duì)照品混合溶液。1.3柱后分流,b方分流色譜柱:AgilentZORBAXSB-C18(100mm×3.0mm,3.5μm),柱溫為25℃,進(jìn)樣體積4μl,流速0.6ml/min,柱后分流比為1：1。A相為0.1%甲酸-水,B相為甲醇。梯度洗脫程序如下:0～10min30%～45%B;10～15min45%～50%B;15～20min50%～60%B;20～35min60%～70%B;35～40min70%～90%B;40～42min90%～95%B。1.4負(fù)離子模式下干燥氣溫度5.3.3采用ESI源,正離子模式下:毛細(xì)管電壓4000V,霧化器壓力30psi(1psi=6894.8Pa),干燥氣流速8L/min,干燥氣溫度350℃,碎片電壓160V;負(fù)離子模式下:毛細(xì)管電壓3500V,霧化器壓力30psi,干燥氣流速8L/min,干燥氣溫度350℃,碎片電壓160V。質(zhì)量數(shù)掃描范圍m/z200～1500。1.5化學(xué)成分分析根據(jù)小柴胡湯各組方藥材的化學(xué)成分研究文獻(xiàn),收集了皂苷類(lèi)、黃酮類(lèi)、二苯基庚烷類(lèi)、姜辣素類(lèi)成分及部分生物堿和有機(jī)酸類(lèi)化學(xué)成分共415個(gè),建立相應(yīng)的化學(xué)成分分子式數(shù)據(jù)庫(kù)。2結(jié)果和討論2.1色譜峰的建立由于中藥復(fù)方化學(xué)成分復(fù)雜,因此采用梯度洗脫分離被測(cè)化合物。實(shí)驗(yàn)中考察了乙腈-水、甲醇-水系統(tǒng),發(fā)現(xiàn)甲醇-水可使小柴胡湯中各色譜峰得到較好分離,加入甲酸可以?xún)?yōu)化峰形;質(zhì)譜的檢測(cè)靈敏度取決于被測(cè)化合物的離子化程度,而在流動(dòng)相中加入甲酸有助于化合物的離子化,提高質(zhì)譜響應(yīng),有助于小柴胡湯中含量極少化合物的檢測(cè)。通過(guò)自建化合物數(shù)據(jù)庫(kù)可知目標(biāo)化合物的相對(duì)分子質(zhì)量范圍,在既定的分子量范圍進(jìn)行質(zhì)譜掃描,減少噪音,降低本底,增加色譜峰的分離度。小柴胡湯的總離子流圖見(jiàn)圖1。2.2使用對(duì)照品區(qū)分五個(gè)組的異構(gòu)體實(shí)驗(yàn)中采用甘草苷、黃芩苷、漢黃芩苷、人參皂苷Rg1、甘草酸等對(duì)照品區(qū)分了5組同分異構(gòu)體,混合對(duì)照品的總離子流圖見(jiàn)圖2。2.3精確質(zhì)量的元素組成以人參皂苷Re為例說(shuō)明小柴胡湯中色譜峰的鑒別過(guò)程。保留時(shí)間為18.49min色譜圖中的準(zhǔn)分子離子包括969.53900、985.51738。計(jì)算精確質(zhì)量數(shù)的可能元素組成,并根據(jù)準(zhǔn)分子離子之間的相互聯(lián)系,確定元素組成分別為C48H82NaO18、C48H82KO18。計(jì)算C48H82O18的核素分布情況,與實(shí)際情況進(jìn)行比對(duì),從圖3可以看出核素分布的理論值與實(shí)際值基本符合,確定此峰為人參皂苷Re。2.4小柴胡湯藥物成分的初步篩選小柴胡湯各組方藥材中同分異構(gòu)體較多,除用少量對(duì)照品區(qū)分同分異構(gòu)體外,實(shí)驗(yàn)中采用ACD/ChemSketch軟件計(jì)算化合物的logP值判斷保留時(shí)間。如neoliquiritin、liquiritin、isoliquiritin、neoisoliquiritin為同分異構(gòu)體,在HPLC-TOF-MS總離子流圖中,提取m/z為419.13的離子,結(jié)果見(jiàn)圖4。采用ACD/ChemSketch軟件計(jì)算neoliquiritin、liquiritin、isoliquiritin、neoisoliquiritin的logP值分別為0.22、0.61、0.76、1.0,表明4個(gè)化合物的疏水強(qiáng)弱順序?yàn)閚eoliquiritin>liquiritin>isoliquiritin>neoisoliquiritin,根據(jù)其保留時(shí)間先后順序,結(jié)合各化合物的logP值,可對(duì)4個(gè)化合物進(jìn)行初步推斷。從小柴胡湯總離子流圖可以看出,有一些響應(yīng)較好的色譜峰,其質(zhì)量數(shù)未能在已有數(shù)據(jù)庫(kù)中找到。表明小柴胡湯中還有大量的未知成分,有待于進(jìn)一步研究。由于高分辨飛行時(shí)間質(zhì)譜的高靈敏度和中藥復(fù)方成分的復(fù)雜性,難以檢