基因重組與基因工程概述基因重組與基因工程概述中心法則

逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄

RNA翻譯

蛋白質(zhì)復制DNA生物體環(huán)境

基因的表達調(diào)控

適應(yīng)環(huán)境中心法則逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄RNA翻譯蛋白質(zhì)復制了解中心法則

對天然的DNA進行改造為人類服務(wù)基因工程了解中心法則對天然的DNA進行改造為人類服務(wù)基因工程

即DNA重組技術(shù)。在分子水平上進行遺傳操作，按設(shè)計的藍圖，從供體中提取或人工合成目的基因，使其與載體構(gòu)建成重組DNA，再轉(zhuǎn)移到受體細胞。目的基因在受體細胞中表達，獲得新的遺傳性狀。

基因工程即DNA重組技術(shù)。在分子水平上進行遺傳操蘇云金芽胞桿菌（BT）毒素蛋白基因

蘇云金芽胞桿菌（BT）毒素蛋白基因熒光蛋白酶基因熒光蛋白酶基因轉(zhuǎn)胃安素番茄高鋅西洋番茄轉(zhuǎn)蝦青素胡蘿卜痢疾疫苗土豆轉(zhuǎn)胃安素番茄高鋅西洋番茄轉(zhuǎn)蝦青素胡蘿卜痢疾疫苗土豆乳汁中分泌人凝血因子的轉(zhuǎn)基因山羊

乳汁中分泌人蛋白因子的轉(zhuǎn)基因豬乳汁中分泌人凝血因子的乳汁中分泌人蛋白因子基因重組與基因工程概述課件主要內(nèi)容DNA重組

重組DNA技術(shù)

重組DNA與醫(yī)學的關(guān)系主要內(nèi)容DNA重組

不同DNA之間發(fā)生共價連接形成新的DNA分子?；蛞苿雍椭亟M是生物界普遍現(xiàn)象，是生物進化的動力，DNA重組具有重要的生物學意義DNA重組概念第一節(jié)DNA重組不同DNA之間發(fā)生共價連接形成新的DNA分子。DNA重DNA重組的類型位點特異性重組（site-specificrecombination）接合(conjugation)轉(zhuǎn)化(tranformation)轉(zhuǎn)導(transduction)同源重組（homologousrecombination）轉(zhuǎn)座重組（transpositionrecombination）細菌的基因轉(zhuǎn)移與重組DNA重組的類型位點特異性重組接合(conjugation)一、細菌的基因轉(zhuǎn)移與重組

接合(conjugation)轉(zhuǎn)化(tranformation)轉(zhuǎn)導(transduction)一、細菌的基因轉(zhuǎn)移與重組接合(conjugation)

（一）接合作用(conjugation)

指通過細胞的直接接觸(如菌毛)，遺傳信息從供體細胞單向轉(zhuǎn)移到受體細胞的過程。

（一）接合作用(conjugation)指通過細胞接合轉(zhuǎn)移F因子染色體DNA性鞭毛接合轉(zhuǎn)移F因子染色體DNA性鞭毛Griffith肺炎球菌轉(zhuǎn)化實驗（二）轉(zhuǎn)化（transformation）Griffith肺炎球菌轉(zhuǎn)化實驗（二）轉(zhuǎn)化（transfo

相關(guān)概念：轉(zhuǎn)化：細胞從周圍介質(zhì)中吸收裸露的DNA,而獲得新的遺傳表型。感受態(tài)細胞（competentcell）:

具有攝取周圍介質(zhì)中游離DNA

分子能力的細菌細胞。相關(guān)概念：轉(zhuǎn)化：細胞從周圍介質(zhì)中吸收裸露感受態(tài)細胞（com

轉(zhuǎn)化過程：DNA片斷細菌攝取DNA片斷重組細菌性狀改變轉(zhuǎn)化過程：DNA片斷細菌攝取DNA片斷重組細菌性狀改變（三）轉(zhuǎn)導（transduction）通過病毒（噬菌體）介導發(fā)生在供體細胞與受體細胞之間的DNA轉(zhuǎn)移和重組過程。（三）轉(zhuǎn)導（transduction）通過病毒（噬菌體）介導溶菌感染重組感染細菌噬菌體

轉(zhuǎn)導溶菌感染重組感染細菌噬菌體轉(zhuǎn)導溶菌途徑溶原途徑噬菌體感染宿主后的兩種結(jié)局溶菌途徑溶原途徑噬菌體感染宿主后的兩種結(jié)局cI基因cro基因溶原狀態(tài)cI基因cro基因溶菌狀態(tài)噬菌體感染宿主菌后的兩種狀態(tài)是由噬菌體的cI和cro兩個基因編碼調(diào)控蛋白控制的，溶原狀態(tài)，cI表達；溶菌狀態(tài)，cro表達。除了控制其他基因表達外，cI和cro兩個基因編碼調(diào)控蛋白是互為阻遏蛋白。結(jié)合協(xié)同cI基因cro基因溶原狀態(tài)cI基因cro基因溶菌狀態(tài)噬菌體感cI基因cro基因溶原狀態(tài)cI基因cro基因溶菌狀態(tài)思考：當含噬菌體的細菌用紫外線輕度照射后，cI蛋白被降解,接下去會發(fā)生什么？停止照射后會怎樣？為什么會進化成這種機制？結(jié)合協(xié)同cI基因cro基因溶原狀態(tài)cI基因cro基因溶菌狀態(tài)思考：當

二、同源重組

（homologousrecombination）

不需要特異DNA序列，而是依賴兩分子之間序列的相同或相似性而進行的重組。同源序列愈長，同源重組率愈高，反之，則不易發(fā)生重組。概念二、同源重組

（homologousrec同源重組意義同源重組發(fā)生在任何生物中。細菌如果通過接合或轉(zhuǎn)化獲得的外源DNA與宿主DNA充分同源，那末外源DNA就可以整合進宿主的染色體。同源重組也是DNA損傷修復的重要機制同源重組意義同源重組發(fā)生在任何生物中。ElectronmicrographofaHollidayJunctionElectronmicrographofaHolliHollidayJunction

(A)ThestructureofaHollidayjunctionboundbyCrerecombinase(gray),abacteriophageprotein.(B)AschematicviewofaHollidayjunction.HollidayJunction

(A)Thestr5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′分支遷移

(recA)5′3′5′3′5′3′5′3′

內(nèi)切酶

(recBCD)5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′3′3′5′5′

內(nèi)切酶(recBCD)5′3′3′3′DNA侵擾(recA)3′5′5′3′5′3′5′3′

DNA

連接酶Holiday中間體5′3′5′3′5′3′5′3′E.coli

的同源重組過程：5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′5′3′Holiday中間體5′3′5′3′5′3′3′5′5′5′5′3′3′3′內(nèi)切酶(ruvC)內(nèi)切酶(ruvC)5′5′5′5′3′3′3′3′5′3′5′5′5′3′3′3′DNA連接酶3′5′5′5′5′3′3′3′拼接重組體DNA連接酶5′5′5′5′3′3′3′3′片段重組體5′3′Holiday中間體5′3′5′3′5′3′3′5′Holliday模型同源重組步驟①兩個同源染色體DNA排列整齊②一個DNA的一條鏈斷裂、并與另一個DNA對應(yīng)的鏈連接，形成Holliday中間體③通過分支移動產(chǎn)生異源雙鏈DNA④Holliday中間體切開并修復，形成兩個雙鏈重組體DNA，分別為：片段重組體(patchrecombinant)拼接重組體(splicerecombinant)Holliday模型同源重組步驟①兩個同源染色體DNA排列整片段重組體

（見模型圖右邊產(chǎn)物）：

切開的鏈與原來斷裂的是同一條鏈，重組體含有一段異源雙鏈區(qū)，其兩側(cè)來自同一親本DNA。5′5′5′5′3′3′3′3′片段重組體片段重組體（見模型圖右邊產(chǎn)物）：5′5′5′5′3′3′拼接重組體（見模型圖左邊產(chǎn)物）：切開的鏈并非原來斷裂的鏈，重組體異源雙鏈區(qū)的兩側(cè)來自不同親本DNA。3′5′5′5′5′3′3′3′拼接重組體拼接重組體（見模型圖左邊產(chǎn)物）：3′5′5′5′5′3′3′

位點特異性重組：由整合酶催化，在兩個DNA位點特異的短序列之間發(fā)生的切割和連接反應(yīng):

噬菌體DNA整合細菌特異位點重組免疫球蛋白基因的重排三、位點特異性重組位點特異性重組：由整合酶催化，在兩個DNA位點特異的短（一）λ噬菌體DNA的整合λ噬菌體的整合酶識別噬菌體和宿主染色體的特異靶位點發(fā)生選擇性整合；反轉(zhuǎn)錄病毒整合酶可特異地識別、整合反轉(zhuǎn)錄病毒cDNA的長末端重復序列(longterminalrepeat,LTR)。

（一）λ噬菌體DNA的整合attPattBE.coliDNAInt,IHFInt,IHF,Xis

DNA噬菌體DNA的整合和切除att:attachmentsite,Int:integrase,IHF:integrationhostfactor,Xis:excisionasePOP′BOB′BOP′POB′attLattR整合切除attPattBE.coliDNAInt,IHFInthix為反向重復序列，它們之間的H片段可在Hin控制下進行特異位點重組(倒位)。H片段上有兩個啟動子P，其一驅(qū)動hin基因表達，另一正向時驅(qū)動H2和rH1基因表達，反向(倒位)時H2和rH1不表達。rH1為H1的阻遏蛋白基因。（二）細菌的特異位點重組沙門氏菌H片段特異位點重組(倒位)決定鞭毛相轉(zhuǎn)變hix為反向重復序列，它們之間的H片段可在Hin控制下進行特DNAH片段

h1H2與阻遏基因mRNAHin重組酶H2鞭毛素阻遏蛋白(a)

hinh2阻遏基因rh1啟動序列hinmRNAPPhixhix

hinh2阻遏基因rh1H片段倒位

h1hinmRNAH1mRNAHin重組酶H1鞭毛素(b)

hinPP沙門氏菌H片段特異位點重組(倒位)決定鞭毛相轉(zhuǎn)變（二）細菌的特異位點重組DNAH片段h1H2與阻遏基因mRNAHin重組（三）、免疫球蛋白基因的重排免疫球蛋白(Ig)，由兩條輕鏈(L鏈)和兩條重鏈(H鏈)組成，分別由三個獨立的基因族編碼，其中兩個編碼輕鏈(

和

)，一個編碼重鏈。輕鏈的基因片段：重鏈的基因片段：LVJCLV

D

JC（三）、免疫球蛋白基因的重排免疫球蛋白(Ig)，由兩條輕鏈(Theorganizationofmouseimmunoglobulingenesegments.Theorganizationingermlinecellsisshownontheleft,andtherearrangedorganizationcharacteristicofmatureBlymphocytesisshowntotherightofthearrows.Therearrangedstatesshownarebutsingleexamplesofthemanypossibilitiesforeachgenefamily.TheorganizationofmouseimmuConsensuselementsarelocatedaboveandbelowgermlinevariable-regiongenesthatrecombinetoformgenesencodingimmuno-globulinchains.Theseconsensuselementsarecomplementaryandarearrangedinaheptamer-nonamer,12-bpto23-bpspacerpattern.-Chain-Chain

H-Chain231223122312CACAGTGACAAAAACCACAAAAAACCCACAGTGConsensuselementsarelocated此重排的重組酶基因rag(recombinationactivatinggene)共有兩個，分別產(chǎn)生蛋白質(zhì)RAG1和RAG2。RAG1識別九核苷酸序列，RAG2加入復合物，切割七核苷酸序列位點等CACAGTGACAAAAACCGTGTCACTGTTTTTGG7核苷酸序列12/23間隔序列9核苷酸序列重組信號序列（RSS）重排機制：重鏈(IgH)基因的V-D-J重排和輕鏈(IgL)基因的V-J重排均發(fā)生在特異位點上。在V片段的下游，J片段的上游以及D片段的兩側(cè)均存在保守的重組信號序列(recombinationsignalsequence,RSS)。此重排的重組酶基因rag(recombinationacV片段J片段RSSRSS間插DNAOHHOVJ單鏈切開RAG1RAG2分子內(nèi)轉(zhuǎn)酯反應(yīng)單鏈切開轉(zhuǎn)移核苷酸修復、連接免疫球蛋白基因重排過程-OH親核攻擊V片段J片段RSSRSS間插DNAOHHOVJ單鏈切開RAG四轉(zhuǎn)座重組（transposition）由插入序列和轉(zhuǎn)座子介導的基因轉(zhuǎn)移或重排。許多數(shù)細菌基因組含有幾十個拷貝的能轉(zhuǎn)座DNA片段，片段長度從幾百到幾萬個bp,是遺傳多樣性的一個重要來源。四轉(zhuǎn)座重組（transposition）由插入序列和轉(zhuǎn)座轉(zhuǎn)座重組分類：插入序列(insertionsequence，IS)轉(zhuǎn)座:

由轉(zhuǎn)座酶（transposase）、一個分離的反向重復序（invertedrepests）列和側(cè)翼二個正向重復序列（directrepeats）組成。

發(fā)生形式：保守性轉(zhuǎn)座(conservativetransposition)

復制性轉(zhuǎn)座(duplicativetransposition)轉(zhuǎn)座子（transposon，Tn）轉(zhuǎn)座：除了有插入序列的結(jié)構(gòu)外，還帶有抗性或其他標記基因。轉(zhuǎn)座重組分類：轉(zhuǎn)座序列結(jié)構(gòu)反向重復序列轉(zhuǎn)座序列結(jié)構(gòu)反向重復序列反向重復序列轉(zhuǎn)座酶基因IS轉(zhuǎn)座酶基因ampR反向重復序列Tn3轉(zhuǎn)座酶基因tetRTn10IS細菌中的三種轉(zhuǎn)座子類型反向重復序列轉(zhuǎn)座酶基因IS轉(zhuǎn)座酶基因ampR反向重復序列Tn插入序列的復制性轉(zhuǎn)座插入序列的復制性轉(zhuǎn)座轉(zhuǎn)座子(transposons)

——可從一個染色體位點轉(zhuǎn)移到另一位點的分散重復序列。

轉(zhuǎn)座子組成：反向重復序列轉(zhuǎn)座酶編碼基因抗生素抗性等有用的基因IRIRTransposaseGene有用基因轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座轉(zhuǎn)座子(transposons)——可從一個染色體位點轉(zhuǎn)移基因重組與基因工程概述課件由轉(zhuǎn)座子介導的轉(zhuǎn)座由轉(zhuǎn)座子介導的轉(zhuǎn)座Exonshufflingbytransposition.(a)TranspositionofanexonflankedbyhomologousDNAtransposonsintoanintrononasecondgene.transposasecanrecognizeandcleavetheDNAattheendsofthetransposoninvertedrepeats.Ingene1,ifthetransposasecleavesattheleftendofthetransposonontheleftandattherightendofthetransposonontheright,itcantransposealltheinterveningDNA,includingtheexonfromgene1,toanewsiteinanintronofgene2.Thenetresultisaninsertionoftheexonfromgene1intogene2.

轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座---外顯子重組（混編）Exonshufflingbytranspositio

外顯子混編（Exonshuffling）：產(chǎn)生許多新功能的蛋白質(zhì)外顯子混編是生物進化的一個重要過程，得益于真核生物DNA編碼序列的組織方式：斷裂基因含有長長的內(nèi)含子，含有許多的重復序列，并處于外顯子的兩側(cè)。因此，內(nèi)含子的存在提供了外顯子混編的基礎(chǔ)。有人提出人基因組編碼的約6萬種蛋白質(zhì)是從幾千個獨立的外顯子混編而來。外顯子混編（Exonshuffling第二節(jié)重組DNA技術(shù)重組DNA技術(shù)相關(guān)概念及意義重組DNA技術(shù)的原理及過程重組DNA技術(shù)與醫(yī)學關(guān)系第二節(jié)重組DNA技術(shù)重組DNA技術(shù)相關(guān)概念及意義一、重組DNA技術(shù)相關(guān)概念及意義

（一）有關(guān)DNA克隆的相關(guān)概念克?。╟lone）:通過無性繁殖過程所產(chǎn)生的與親代完全相同的子代群體，這一群體可以是分子、細胞、動物或植物等。獲取這一群體的過程稱為克隆化（cloning）DNA克隆(DNAcloning)

：是按人類的意愿，在體外對DNA分子進行重組，再將重組分子導入受體細胞，使其在細胞中擴增和繁殖，以獲得該DNA分子的大量拷貝。又稱分子克隆（molecularcloning)，基因克隆（genecloning）、重組DNA(recombinantDNA)

。一、重組DNA技術(shù)相關(guān)概念及意義（一）有關(guān)DNA克隆的相關(guān)重組DNA技術(shù)(recombinantDNAtechnology)：是指實現(xiàn)基因（或DNA）克隆所采用的方法及技術(shù)路線等。又稱基因工程（geneengineering），遺傳工程（geneticengineering）等。重組DNA技術(shù)(recombinantDNAtechno（二）重組DNA技術(shù)的意義填平了物種間不可逾越的鴻溝；縮短進化時間；對生物定向改造；基因結(jié)構(gòu)、結(jié)構(gòu)功能及調(diào)控研究的基礎(chǔ)；疾病診治（二）重組DNA技術(shù)的意義填平了物種間不可逾越的鴻溝；二、重組DNA技術(shù)的原理及過程二、重組DNA技術(shù)的原理及過程基本過程：分切接轉(zhuǎn)篩基本過程：分（一）工具酶工具酶：系指能用于DNA和RNA分子的切割，連接，聚合，反轉(zhuǎn)錄等有關(guān)的酶系統(tǒng)稱為工具酶。（一）工具酶工具酶：系指能用于DNA和RNA分子的切割，連常用的工具

酶

限制性內(nèi)切核酸酶

(restrictionendonucleases)DNA連接酶

(DNAligase)DNA聚合酶I(DNApolymeraseI)

多核苷酸激酶(polynucleotidekinase)

反轉(zhuǎn)錄酶(reversetranscriptase)DNA末端轉(zhuǎn)移酶(DNAterminaltransferase)

堿性磷酸酶

(alkalinephosphatase)在DNA分子內(nèi)部的特異性的堿基序列內(nèi)部進行切割將兩條以上的線性DNA分子或片段催化形成磷酸二酯鍵連接成一個整體催化DNA切口平移反應(yīng)，制備高比活探針；DNA末端標記，合成cDNA的第二鏈催化將把一個磷酸分子加到多核苷酸鏈的5’－OH末端上以RNA為模板合成互補的cDNA鏈線性雙鏈或單鏈DNA分子的3’－OH末端加上同聚物尾去除DNA,RNA,dNTP的5’末端的磷酸基團工

具酶

主要功

能 常用的工具酶限制性內(nèi)切核酸酶1、限制性核酸內(nèi)切酶（restrictionendonuclease）

定義：是一類能識別和切割雙鏈DNA分子中特定堿基序列的核酸水解酶。分類I型：復合功能酶－內(nèi)切(識別位點周圍400-700bp)、甲基化、ATP酶和DNA解旋；III型：內(nèi)切(識別位點周圍25-30bp)、甲基化II型：識別和切割雙鏈DNA的特異順序(識別位點內(nèi))1、限制性核酸內(nèi)切酶（restrictionendonuc命名：根據(jù)酶的微生物學名命名：如：Escherichiacoli,R株中幾種限制酶：

EcoRI，EcoR

II，EcoR

V第一字母（大寫，斜體），示該酶微生物屬名；第二、三字母（小寫，斜體），示該酶微生物種名；第四字母（大寫，斜體），示該酶微生物株或型；如一種菌株中有多種限制性內(nèi)切酶，用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)分離的先后順序。

命名：根據(jù)酶的微生物學名命名：

II型限制性內(nèi)切酶的作用特點

識別序列４～６個堿基，4個核苷酸序列，則每４４（２５６）個堿基出現(xiàn)一個靶序列；6個核苷酸序列出現(xiàn)的間隔是4kb,8個核苷酸序列則是65kb?；匚慕Y(jié)構(gòu)（palindrome）三種不同的切口：平末(bluntend)端、５’－突出粘性末端(cohensiveendorstick)３’－突出粘性末端II型限制性內(nèi)切酶的作用特點限制性核酸內(nèi)切酶三種切口

產(chǎn)生5′突出粘性末端（stickyend):以EcoRI為例：

5′---GAATTC---3′5′---GP

OHAATTC---3′3′---CTTAAG---5′EcoRI

3′---CTTAAOHPG---5′產(chǎn)生3′突出粘性末端:以PstI為例：

5′---CTGCAG---3′5′---CTGCAp

OHG---3′3′---GACGTC---5′

PstI3′---GOHpACGTC---5′產(chǎn)生平末端（bluntend):以NruI為例：

5′---TCGCGA---3′5′---TCGp

OHCGA---3′3′---AGCGCT---5′

NruI3′---AGCOHpGCT---5′限制性核酸內(nèi)切酶三種切口產(chǎn)生5′突出粘性末端（stickyII型限制性內(nèi)切酶的用途：

DNA克隆

DNA雜交與序列分析改建質(zhì)粒構(gòu)建基因組圖譜和文庫限制與修飾系統(tǒng)（restriction

–

modification

，R-M系統(tǒng)）：

甲基化酶與相關(guān)的II型限制性內(nèi)切酶組成，它們識別相同序列，發(fā)揮不同功能。

如：EcoRIrestrictionendonuclease和EcoRImethylaseII型限制性內(nèi)切酶的用途：restriction–modification(a)EcoRI,arestrictionenzymefromE.coli,makesstaggeredcutsatthespecific6-bpinvertedrepeatsequenceshown.Thiscleavageyieldsfragmentswithsingle-stranded,complementary“sticky”ends.Manyotherrestrictionenzymesalsoproducefragmentswithstickyends.(b)Bacterialcellswithrestrictionendonucleasesalsocontaincorrespondingmodificationenzymesthatmethylatebasesintherestriction-recognitionsite.Forexample,E.colicellscontainingtheEcoRIrestrictionenzymealsocontainEcoRImethylase,amodificationenzymethatcatalyzesadditionofamethylgrouptotwoadeninesintheEcoRIrecognitionsequence.ThemethylatedrestrictionsiteisnotcleavedbyEcoRI,assuringthatacellmakingthisrestrictionenzymedoesnotdestroyitsownDNA.restriction–modification(a2、DNA聚合酶（DNApolymerases）能合成DNA的酶稱DNA聚合酶。常用的酶：大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ及其大片斷（Klenow片段）TaqDNA聚合酶反（逆）轉(zhuǎn)錄酶末端脫氧核糖核酶轉(zhuǎn)移酶（末端轉(zhuǎn)移酶）2、DNA聚合酶（DNApolymerases）能合成DN(1)大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ5’3’外切酶5’3’聚合酶3’5’外切酶枯草桿菌蛋白酶Klenow片段(1)大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ5’3作用特點：多功能酶：5′→3′DNA聚合酶活性3′→5′外切酶活性5′→3′外切酶活性主要用途:

催化DNA切口平移反應(yīng)，制備高比活探針；DNA測序、合成cDNA第二鏈，及DNA末端標記（Klenow片段）作用特點：多功能酶：5’5’5’5’5’5’DNA酶IDNA聚合酶I（全酶）利用大腸桿菌DNA聚合酶I進行切口平移法Mg2+dATPdCTPdGTPα-32PdTTPT*T*T*T*T*T*5’5’5’5’5’5’5’5’DNA酶IDNA聚合酶I（全酶）利5’5’5’5’5’5’限制性內(nèi)切酶Klenow片段α-32PdNTP變性3’末端32P標記的單鏈DNA探針利用Klenow片斷進行3’端標記5’末端突出的DNA5’5’5’5’5’5’限制性內(nèi)切酶Klenow片段變性3（2）TaqDNA聚合酶1988年saiki在嗜熱水生菌(thermusaquaticus)分離出耐熱的依賴于DNA的DNA聚合酶，MW=65kD，主要應(yīng)用于聚合酶鏈反應(yīng)（polymerasechainreaction,PCR）中對DNA分子的特定序列進行體外擴增（2）TaqDNA聚合酶1988年saiki在嗜熱（3）反轉(zhuǎn)錄酶(reversetranscriptase)

亦稱依賴于RNA的DNA聚合酶（RDDP)催化以RNA為模板的DNA聚合反應(yīng)，以mRNA為模板，催化合成出互補的DNA，稱為cDNA(com-plementaryDNA)。主要用于cDNA文庫的構(gòu)建。3′→5′外切酶活性（又稱RNA酶H活性），特異性降解RNA-DNA雜交分子中的RNA部分（3）反轉(zhuǎn)錄酶(reversetranscriptase（4）末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶

（末端轉(zhuǎn)移酶,terminaltransferase）催化作用：在二價陽離子存在下，它催化dNTP加到DNA分子的3′羥基端。用途：用于給載體或cDNA加上互補的多聚體尾巴，造成便于重組的人工粘性末端；用于DNA片斷3′-末端標記。（4）末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶

（末端轉(zhuǎn)移酶,terminaAAAA·····An3’mRNAAAAA·····An3’mRNATTTT5’cDNATTTT5’GGGGGGGGTTTT5’5’CCCCAAAAOligo(dT)引物反轉(zhuǎn)錄酶dNTPOligo(dC)引物Taq

DNA聚合物（或Klenow片段）dNTP去除mRNA鏈加oligo(dG)末端轉(zhuǎn)移酶cDNA雙鏈全長雙鏈cDNA的合成5’5’3’3’3’3’AAAA·····An3’mRNAAAAA···3、DNA連接酶(ligase)催化兩個獨立DNA片段的5′磷酸基與3′羥基之間形成磷酸二酯鍵，使DNA片段拼接起來T4連接酶：粘性末端和平末端；大腸桿菌連接酶：粘性末端3、DNA連接酶(ligase)4、多核苷酸激酶（polynucleotidekinase）寡核苷酸探針標記；用于連接反應(yīng)，使缺少５’端磷酸的DNA片段合成接頭磷酸化NNNNNHOAd-P-P-P5

3NNNNNP5

3+Ad-P-P+[-32P]ATPADP寡核苷酸片段32P標記的寡核苷酸片段多核苷酸激酶4、多核苷酸激酶（polynucleotidekinase（二）基因載體（vector）

載體（vector）：攜帶目的DNA片段進入宿主細胞進行擴增和/或表達的一類DNA分子。載體特征：自主復制即有復制原點（必需）酶切位點（必需）大小適合篩選標記:如抗藥性、營養(yǎng)標記、

-半乳糖苷酶顯色反應(yīng)等拷貝數(shù)高（二）基因載體（vector）載體（vector）：攜帶載體類型：來源:質(zhì)粒；噬菌體；病毒,酵母人工染色體功能:

克隆載型體和表達型載體受體細胞:

原核細胞載體、真核細胞載體和穿梭載體（shuttlevector）載體類型：質(zhì)粒（plasmid）：細菌染色體外小型雙鏈環(huán)狀DNA。質(zhì)粒復制的類型：嚴緊型：1-5拷貝，與細菌復制密切相關(guān)松弛型：10-200拷貝以上常用載體：pBR322：4.36kb；人工構(gòu)建；Tetr和Ampr；多克隆位點，松弛型pUC系列質(zhì)粒：pBR322和M13噬菌體改建,2.674kb；Ampr；藍白斑篩選（lacZ'，

-肽）；高拷貝（500-700）1、質(zhì)粒載體

質(zhì)粒（plasmid）：細菌染色體外小型雙鏈環(huán)狀DNA。1、用途：保存與擴增<2kb的目的基因構(gòu)建cDNA文庫測序制備探針用途：復制點：ori篩選標記：ampr,tetr克隆位點：多個單一限制性內(nèi)切酶位點復制點：ori基因重組與基因工程概述課件2、噬菌體載體（bacterieophagevector）2、噬菌體載體（bacterieophag基因組特點：50kb雙鏈DNA分子，末端12bp為互補單鏈（cos位點，又稱粘端）兩個啟動子：PR和PL編碼基因：包裝蛋白，裂解功能蛋白等生長方式：溶菌性生長（組裝噬菌體）溶源性生長（整合入細菌DNA內(nèi)）λ噬菌體載體（BacteriophageLambda）基因組特點：λ噬菌體載體（BacteriophageLamcosTACGGGGCGGCGACCTCGCGATGCCCCGCCGCTGGAGCGCCos序列及酶切割位點cosTACGGGGCGGCGACCTCGCGCos序列及酶載體種類：插入載體（insertionvector）：外源性DNA直接插入酶切位點（EcoRⅠ）容量：幾個kb代表載體：λgt10；λgt11用途：構(gòu)建cDNA文庫替代載體（substitutionvector）：外源性DNA替代載體中央部分酶切位點：EcoRⅠ；BamHⅠ；SalⅠ容量：9-22kb代表載體：EMBL4用途：構(gòu)建基因組文庫載體種類：coscoscoscoscoscoscIEcoRIEcoRIlacZE,B,SE,B,Sgt10gt11EMBL4

噬菌體插入載體和替代載體示意圖coscoscoscoscoscoscIEcoRIEcoR3、柯斯質(zhì)粒載體（cosmid）基因組組成：質(zhì)粒與噬菌體的cos位點聯(lián)合構(gòu)成、4-6kb、質(zhì)粒復制起始位點、酶切位點、抗藥性基因；容量：29-45kb代表載體：pGEM-3Zf（-）工作方式：具有噬菌體樣的包裝和感染，又具有質(zhì)粒樣的復制用途：基因組文庫3、柯斯質(zhì)粒載體（cosmid）基因組組成：質(zhì)粒與噬菌體的c基因重組與基因工程概述課件（三）目的基因（targetgene）1、目的基因的用途研究該基因的全貌與內(nèi)涵：結(jié)構(gòu)、功能、調(diào)控尋找異?；虍惓｜c，探索疾病的機理與治療研究生物種系進化與相關(guān)同源性基因工程重組表達改造某些基因，以改良品種基因治療（三）目的基因（targetgene）1、目的基因的用途2、獲得目的基因的方法

原核目的基因獲得：直接分離真核目的基因獲得：基因組文庫篩選cDNA文庫篩選人工合成PCR合成2、獲得目的基因的方法

原核目的基因獲得：直接分離DNA文庫概念

DNA文庫（DNAlibrary）：通過重組、克隆方法保存在宿主細胞中的各種重組DNA分子的集合體。分兩類：基因組文庫(genomiclibrary)：將某種生物細胞的基因組DNA切割成一定大小的片段后，分別與合適的載體重組并導入宿主細胞內(nèi)克隆保存。這種保存在宿主細胞內(nèi)的整個基因組DNA片段集合體稱~。cDNA文庫(cDNAlibrary)：將分離純化獲得某種真核細胞中的全部mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，并通過重組、克隆方法保存在宿主細胞中。這種保存在宿主細胞內(nèi)的cDNA集合體稱~。DNA文庫概念用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）方法獲取目的基因用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）方法獲取目的基因3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’第一次循環(huán)：變性（95oC）退火延伸（72oC）第二次循環(huán)3’5’5’3’3’5’5’3’第三次循環(huán)25~30次循環(huán)后模板DNA含量可以擴大100萬百倍以上PCR原理模板DNA引物引物3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’第一次循環(huán)：用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）方法獲取目的基因一對引物分別含有BamHI和HindIII位點，PCR產(chǎn)物經(jīng)雙酶切后，可定向插入載體。用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）方法獲取目的基因一對引物分別含有Ba（四）外源基因與載體的連接作用酶：DNA連接酶連接方式：粘性末端連接平末端同聚物加尾連接人工接頭

（四）外源基因與載體的連接作用酶：DNA連接酶基因重組與基因工程概述課件基因重組與基因工程概述課件人工接頭連接法BamHI接頭連接酶BamHI切割連接酶+BamHI切割的pBR322人工接頭連接法BamHI接頭連接酶BamHI切割連接酶+（五）重組DNA導入受體菌1、重組子導入受體菌的方式

：轉(zhuǎn)化（transformation）：特指將質(zhì)粒DNA或以它為載體構(gòu)建的重組子導入細菌的過程。轉(zhuǎn)染（transfection）：病毒及其重組子導入受體細胞。（五）重組DNA導入受體菌1、重組子導入受體菌的方式：2、導入方法氯化鈣法感受態(tài)

：細菌處于容易吸收外源DNA的狀態(tài)稱感受態(tài)

制備條件：冰浴、低滲CaCl2（

0.1mol/L）

轉(zhuǎn)化反應(yīng)：冰浴30分短暫熱休克（42℃）

轉(zhuǎn)化效率：105-106/μgDNA;環(huán)狀DNA高于線狀DNA1000倍電穿孔法：電穿孔儀2、導入方法氯化鈣法（六）重組子的篩選與鑒定1、陽性菌落篩選：抗藥性標志：ampr、tetr、neor插入抗性失活互補篩選：藍白斑篩選（α-互補）、營養(yǎng)缺陷互補分子雜交：原位雜交、southern雜交（六）重組子的篩選與鑒定1、陽性菌落篩選：2、插入外源性DNA的鑒定：酶切（目的片段長度）PCR測序3、表達蛋白的鑒定：免疫學、生物學活性2、插入外源性DNA的鑒定：抗藥性篩選抗藥性篩選多克隆位點啟動子裂開的N端裂開的N端外源DNA

半乳糖苷酶N端編碼序列pUC182686bppUC182686bp染色體重組體pUC18細菌在含X-gal和乳糖操縱子誘導劑的瓊脂上培養(yǎng)細菌在含X-gal和乳糖操縱子誘導劑的瓊脂上培養(yǎng)pUC18含重組體pUC18的白色菌落藍色菌落含載體pUC18的藍色菌落

半乳糖苷酶C端編碼序列轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化

利用互補原理篩選（蘭白斑篩選）重組子pUC18amprampr多克隆位點啟動子裂開的N端裂開的N端外源DNA半乳糖藍白斑篩選重組質(zhì)粒藍白斑篩選重組質(zhì)粒原位雜交RadioactiveprobewillhybridizewithitscomplementaryDNAWashfilter,prepareautoradiographandcomparewithmasterplatePlacenitrocellulosefilterinsealableplasticbagwithsolutionoflabeledDNAprobe原位雜交RadioactiveprobewillhybSouthernblotSouthernblot免疫學方法篩選重組子免疫學方法篩選重組子DNA重組技術(shù)實例：

基因文庫構(gòu)建與篩選DNA重組技術(shù)實例：

人基因組文庫構(gòu)建

ConstructionofagenomiclibraryofhumanDNAinabacteriophagelvector.

人基因組DNA用限制性內(nèi)切酶（Sau3A）部分消化產(chǎn)生約20-kb帶粘性末端的部分重疊的隨機片段；載體消化：噬菌體DNA用BamH1消化，去掉中間的可置換片段，并產(chǎn)生左右兩個帶粘性末端的片段基因組片段與噬菌體DNA拼接成重組DNA體外裝配有活性的噬菌體，并感染大腸桿菌菌種培養(yǎng)、篩選、擴增保存InfectE.coliIndividualclones人基因組文庫構(gòu)建

ConstructionofagenProductionofoverlappingrestrictionfragmentsbypartialdigestionofhumangenomicDNAwithSau3A.

Thisrestrictionendonucleaserecognizesthe4-bpsequenceGATCandproducesfragmentswithsingle-strandedstickyendswiththissequenceonthe5’endofeachstrand.AhypotheticalregionofhumangenomicDNAshowingtheSau3Arecognitionsites(red)isshownatthetop.PartialdigestionofthisregionofDNAwouldyieldavarietyofoverlappingfrag