響應(yīng)面法優(yōu)化蒙古櫟葉片抗氧化活性提取工藝

蒙古阿爾特羅夫是地殼植物科的一種多年生樹(shù)木，屬于中國(guó)北方廣泛分布的樹(shù)種。然而，蒙古阿爾特資源的利用率很低，通常只使用樹(shù)干來(lái)加工和使用，而葉片和其他可再生資源很少。蒙古的樹(shù)皮曾被用作蠶繭和鹿飼料，但缺乏更廣泛的應(yīng)用方法。這些葉子通常被用作初始燃料。在實(shí)踐生產(chǎn)過(guò)程中,由于傳統(tǒng)合成抗氧化劑,如叔丁基-4-羥基茴香醚(BHA)、2,6-二叔丁基對(duì)甲酚(BHT)和2-叔丁基對(duì)苯二酚(TBHQ)等對(duì)人體具有毒副作用,聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)和世界衛(wèi)生組織食品添加劑委員會(huì)已對(duì)此類化合物的使用做出嚴(yán)格規(guī)定,從天然資源中尋找天然抗氧化物質(zhì)已成為一種趨勢(shì)。同時(shí),研究表明蒙古櫟葉片富含酚類等抗氧化物質(zhì),如張國(guó)友等證實(shí)蒙古櫟葉片內(nèi)含有豐富的酚類物質(zhì),并研究了其抗氧化能力對(duì)生態(tài)學(xué)的意義;王耀輝等對(duì)蒙古櫟葉片中揮發(fā)性成分進(jìn)行了分離和鑒定,其鑒定的蒙古櫟葉片中均含有酚類物質(zhì);Ishimaru等從蒙古櫟葉片中分離出酚苷物質(zhì),如D-threo-guaiacylglycerol-8-O-β-D-(6′-O-galloyl)glucopyranosides,L-threo-guaiacylglycerol-8-O-β-D-(6′-O-galloyl)glucopyranosides,3-methoxy-4-hydroxyphenol-1-O-β-D-(6′-O-galloyl)glucopyranosides,gentisicacid5-O-β-D-(6′-O-galloyl)glucopyranosides,3,5-dimethoxy-4-hydroxyphenol1-O-β-D-(6′-O-galloyl)glucopyranosides,cis-coniferylalcohol4-O-β-D-(6′-O-galloyl)-glucopyranosides等。因此,研究蒙古櫟葉片中酚類等抗氧化物質(zhì)提取工藝及其優(yōu)化具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值和意義。超聲輔助提取是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的新型、高效、避免高溫對(duì)提取成分影響的提取技術(shù),其廣泛應(yīng)用于多酚類物質(zhì)的提取過(guò)程。筆者利用超聲輔助提取法對(duì)蒙古櫟葉片多酚提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化。在單因素篩選的基礎(chǔ)上,應(yīng)用響應(yīng)面法對(duì)主要影響因素進(jìn)行考察,并以多酚質(zhì)量和清除ABTS自由基能力雙響應(yīng)因子進(jìn)行3因素3水平的試驗(yàn)設(shè)計(jì),同時(shí),對(duì)分離的蒙古櫟多酚的抗氧化能力采用DPPH體系進(jìn)行了驗(yàn)證,以期為蒙古櫟多酚在天然抗氧化功能產(chǎn)品和食品抗氧化添加劑領(lǐng)域的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。1材料和方法1.1蒙古櫟葉片制備KQ-250DB型臺(tái)式數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)、UV-2550型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本島津公司)、HZS-HA型水浴振蕩器(哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司)、RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海青浦滬西儀器廠)、SHB-III型循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)、BS210S型電子天平(德國(guó)Sartorius公司)。所用蒙古櫟位于黑龍江省哈爾濱市東北林業(yè)大學(xué)校內(nèi)(北緯45°43.096′~45°43.097′,東經(jīng)126°38.036′~126°38.037′),并經(jīng)森林植物生態(tài)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(東北林業(yè)大學(xué))聶紹荃教授鑒定,確定為目標(biāo)樹(shù)種。蒙古櫟葉片采摘于2008年9月,自然陰干,葉片使用前粉碎并篩分,取粒徑為250~850μm的葉片粉末作為試驗(yàn)材料。福林酚(Folin-Ciocalteu)試劑、1,1-二苯代苦味?；杂苫?DPPH)、2,2-吖嗪雙(3-乙基-7-苯并噻唑啉磺酸)二銨鹽(ABTS)、水溶性維生素E(Trolox)、二丁基羥基甲苯(BHT)、特丁基-4-羥基茴香醚(BHA)、L-抗壞血酸(VC)和維生素E(VE)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司,沒(méi)食子酸對(duì)照品購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所,其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。1.2提取物多酚含量的測(cè)定采用福林酚法測(cè)定多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù),結(jié)果以每克提取物中含有相當(dāng)沒(méi)食子酸的毫克數(shù)來(lái)表示。以吸光度為橫坐標(biāo),沒(méi)食子酸質(zhì)量濃度(g·L-1)為縱坐標(biāo)表示,線性回歸方程:y=0.270x-0.021(相關(guān)系數(shù)R=0.9964,線性范圍:0.148~1.565g·L-1)。取質(zhì)量濃度為1g·L-1的各提取物樣品甲醇溶液1.0mL與1.0mL福林酚試劑混合,靜置4min后加入1.0mL的10%Na2CO3溶液,最后用去離子水定容至25mL,室溫反應(yīng)2h,在波長(zhǎng)765nm測(cè)定吸光度。各提取物樣品重復(fù)測(cè)定3次,將吸光度取平均值,代入回歸方程,按式(1)計(jì)算多酚的質(zhì)量。Y1=c1×V1。(1)式中:Y1為多酚質(zhì)量(mg);c1為多酚的質(zhì)量濃度(g·L-1);V1為提取液體積(mL)。1.3abts溶液配制參照Wanwisa等的方法(略作改動(dòng))進(jìn)行多酚清除ABTS自由基能力測(cè)定,其中儲(chǔ)備液包括7.4mmol·L-1ABTS溶液和2.6mmol·L-1過(guò)硫酸鉀溶液,用前將2種溶液等量混合,室溫下避光反應(yīng)12h,然后吸取1mL混合液用甲醇稀釋54.7倍,以在波長(zhǎng)734nm處獲得的0.710±0.02吸光值,得到ABTS液。配制濃度為50~600μmol·L-1的Trolox溶液,分別取1mL不同濃度Trolox溶液加入19mLABTS溶液,室溫下避光反應(yīng)2h,在波長(zhǎng)734nm處測(cè)定吸光值。根據(jù)Trolox溶液濃度和反應(yīng)后的吸光度做出線性回歸方程。線性回歸方程:y=-0.001x+0.5994(相關(guān)系數(shù)R=0.9988,線性范圍:50~600μmol·L-1)。蒙古櫟樣品中多酚清除ABTS自由基能力測(cè)定同2.2中多酚清除ABTS自由基能力測(cè)定方法,清除ABTS自由基能力的結(jié)果以樣品中抗氧化物質(zhì)的質(zhì)量摩爾濃度表示,單位為mol·g-1,每樣品重復(fù)測(cè)定3次,結(jié)果取平均值。1.4影響提取效果的因素測(cè)試1.4.1提取條件的確定準(zhǔn)確稱取2.0g蒙古櫟葉片原料,置于50mL錐形瓶中,在選定條件下提取,以多酚質(zhì)量與清除ABTS自由基能力為考察對(duì)象,確定提取因素變化范圍以及各因素的適宜值。1.4.2響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)單因素試驗(yàn)結(jié)果顯示超聲提取過(guò)程的主要影響因素,包括乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間和液料比。以影響因素作為考察對(duì)象,采用DesignExpert7.0統(tǒng)計(jì)分析軟件,分別以多酚質(zhì)量與清除ABTS自由基能力為響應(yīng)值,進(jìn)行響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn),以獲取最適參數(shù)。試驗(yàn)因素和水平安排見(jiàn)表1。1.5測(cè)定sd50值參照Wu等的方法(并略作改動(dòng))進(jìn)行多酚清除DPPH自由基能力測(cè)定,將0.1mL不同質(zhì)量濃度的多酚樣品的95%乙醇液加入3.9mL25mg·L-1DPPH的95%乙醇液中,在黑暗處放置30min后,在波長(zhǎng)為517nm處測(cè)定吸光值,計(jì)為A樣品,以4mL95%乙醇的吸光值為空白對(duì)照,清除DPPH自由基能力用SC(%)表示,SC=(1-A樣/A對(duì)照)×100%,其中A對(duì)照為不加樣品的溶液在t=0時(shí)的吸光值,所有吸光值均測(cè)定3次,結(jié)果取平均值,應(yīng)用SigmaPlot軟件擬合非線性回歸曲線,得出EC50值。2結(jié)果與分析2.1影響提取效果的因素2.1.1提取時(shí)間對(duì)蒙古櫟葉片中多酚含量和清除自由基能力的影響提取時(shí)間對(duì)蒙古櫟葉片中多酚質(zhì)量及清除ABTS自由基能力測(cè)定的影響如表2所示。隨著提取時(shí)間的增加,清除ABTS自由基能力呈遞增趨勢(shì),但30min后增長(zhǎng)趨勢(shì)不明顯。說(shuō)明提取進(jìn)行30min后,提取時(shí)間對(duì)蒙古櫟葉片中多酚質(zhì)量與清除ABTS自由基能力的影響甚小。因此,選擇20~40min為進(jìn)一步優(yōu)化的提取時(shí)間范圍。2.1.2乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)abts自由基能力的影響乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)蒙古櫟葉片中多酚質(zhì)量與清除ABTS自由基能力的影響見(jiàn)表3。隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加,清除ABTS自由基能力在乙醇體積分?jǐn)?shù)為30%時(shí)達(dá)到相對(duì)峰值,但當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)大于30%后,其變化始終處于下降趨勢(shì)。因此,選擇10%~50%為進(jìn)一步優(yōu)化的乙醇體積分?jǐn)?shù)范圍。2.1.3液料比對(duì)abts自由基能力的影響液料比對(duì)蒙古櫟葉片中多酚質(zhì)量與清除ABTS自由基能力的影響見(jiàn)表4。當(dāng)液料比小于15mL·g-1時(shí),清除ABTS自由基能力變化明顯;而當(dāng)液料比大于15mL·g-1時(shí),隨著液料比的增加,其增長(zhǎng)趨勢(shì)放緩。本著節(jié)約溶劑使用量的原則,選擇10~20mL·g-1為進(jìn)一步優(yōu)化的液料比范圍。2.1.4各組abts自由基能力比較考察提取次數(shù)對(duì)蒙古櫟葉片中多酚質(zhì)量與清除ABTS自由基能力的影響,結(jié)果見(jiàn)表5。隨著提取次數(shù)的增加,清除ABTS自由基能力呈遞增趨勢(shì)。當(dāng)提取3次后,其增長(zhǎng)趨勢(shì)不明顯。同時(shí)考慮到增加提取次數(shù),會(huì)增加溶劑的使用量,溶劑回收成本高,提取次數(shù)選擇3次較合理。規(guī)模生產(chǎn)時(shí)亦可考慮提取3次,第3次的提取液可作為下一批次第1次提取的提取溶劑使用,以降低成本。2.2蒙古櫟葉片多酚質(zhì)量對(duì)abts自由基的響應(yīng)響應(yīng)面法試驗(yàn)設(shè)計(jì)組合和蒙古櫟葉片多酚超聲波提取響應(yīng)面法試驗(yàn)中,17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)可以分為兩類:一類是析因點(diǎn),自變量取值在A、B、C所構(gòu)成的三維頂點(diǎn),共有12個(gè)析因點(diǎn);另一類是以零點(diǎn)作為區(qū)域的中心點(diǎn),零點(diǎn)試驗(yàn)重復(fù)5次,用以估計(jì)試驗(yàn)誤差。響應(yīng)面法試驗(yàn)設(shè)計(jì)與試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表6。以蒙古櫟葉片中多酚質(zhì)量與清除ABTS自由基能力為響應(yīng)值,經(jīng)回歸擬合后,根據(jù)DesignExpert7.0統(tǒng)計(jì)分析軟件中ANOVA分析,試驗(yàn)?zāi)Ｐ惋@著。具體參數(shù)見(jiàn)表7和表8。在各項(xiàng)方差分析中,當(dāng)p值小于0.05時(shí)表明影響顯著;p值小于0.001時(shí)表明影響極為顯著。因此,在多酚質(zhì)量中,C的一次項(xiàng)對(duì)多酚質(zhì)量影響極顯著;A2和B2對(duì)多酚質(zhì)量影響顯著(表7)。在清除ABTS自由基能力中,C的一次項(xiàng)對(duì)清除ABTS自由基能力的影響極顯著;A2、B2和BC對(duì)清除ABTS自由基能力影響顯著,參見(jiàn)表8。采用DesignExpert7.0統(tǒng)計(jì)分析軟件,對(duì)多酚質(zhì)量與清除ABTS自由基能力進(jìn)行最優(yōu)化設(shè)計(jì),得到蒙古櫟葉片多酚提取條件為:乙醇體積分?jǐn)?shù)28.62%,提取時(shí)間30.90min,液料比19.96mL·g-1,提取次數(shù)為3次。2.0g蒙古櫟葉片原料中多酚質(zhì)量為84.88mg;ABTS自由基清除能力為0.79mol·g-1。2.3清除dpph自由基能力抗氧化劑對(duì)DPPH自由基的清除能力一般用EC50值表示,即達(dá)到DPPH清除率50%時(shí)抗氧化劑的質(zhì)量濃度。將蒙古櫟葉片多酚樣品配制成不同質(zhì)量濃度的溶液,檢測(cè)其對(duì)DPPH自由基的清除效果,并與4種合成抗氧化劑BHT、BHA、VC和VE的清除效果進(jìn)行比較,結(jié)果見(jiàn)表9。經(jīng)SigmaPlot軟件處理后,計(jì)算出4種合成抗氧化劑BHT、BHA、VC、VE和蒙古櫟葉片多酚清除DPPH自由基能力的回歸曲線分別為:BHT:y=-8611.75x2+1425.1152x+6.3018,R=0.9604;BHA:y=-13245.2477x2+2160.0086x+4.6515,R=0.9893;VC:y=-14462.256x2+2291.0282x+4.8877,R=0.9891;VE:y=-8431.7396x2+1406.4228x+6.227,R=0.9607;多酚樣品:y=-161.3255x2+254.0954x+0.8907,R=0.9891。不同抗氧化劑的EC50值分別為:蒙古櫟葉片多酚223mg·L-1、BHA246mg·L-1、BHT406mg·L-1、VC230mg·L-1、VE414mg·L-1。可知分離的蒙古櫟葉片多酚清除自由基的能力要強(qiáng)于合成抗氧化劑,并且蒙古櫟葉片多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)與DPPH清除能力具有明顯的量效關(guān)系。3蒙古櫟葉片抗氧化活性的檢測(cè)采用超聲提取法對(duì)蒙古櫟葉片多酚以多酚質(zhì)量與清除ABTS自由基能力為雙響應(yīng)因子進(jìn)行提取,在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上對(duì)超聲波提取過(guò)