第七章、質(zhì)粒一、質(zhì)粒的命名二、質(zhì)粒的遺傳特性三、質(zhì)粒的分離、檢測與純化四、質(zhì)粒的復(fù)制和調(diào)節(jié)五、質(zhì)粒的穩(wěn)定性第七章、質(zhì)粒一、質(zhì)粒的命名1質(zhì)粒（plasmid）大多是由DNA組成的環(huán)形分子，比宿主染色體小，在空間上與染色體隔開，能夠自我復(fù)制的遺傳結(jié)構(gòu)，通常具有共價(jià)、閉合、環(huán)狀DNA的基本特征。有些質(zhì)粒即可以整合進(jìn)宿主染色體又可以游離在細(xì)胞質(zhì)中，這類質(zhì)粒又稱為附加體。第七章、質(zhì)粒課件2一、質(zhì)粒的命名由3個(gè)英文字母和編號組成。第1個(gè)小寫字母“p”表示plasmid;后面的2個(gè)大寫字母表示發(fā)現(xiàn)者或構(gòu)建人、構(gòu)建實(shí)驗(yàn)室的名稱；最后是編號。如：質(zhì)粒pBR322是由Bolivar和Rodrigres2位墨西哥學(xué)者所構(gòu)建。質(zhì)粒的命名不能離開宿主，一般將質(zhì)粒寫在宿主名稱后面的括號中，每一個(gè)質(zhì)粒占一個(gè)括號。如：E.coliDH5α(pBR322)E.colik12（F）一、質(zhì)粒的命名由3個(gè)英文字母和編號組成。3二、質(zhì)粒的遺傳特性

1、質(zhì)粒的表型效應(yīng)質(zhì)粒同染色體基因一樣具有一定的表型效應(yīng)。如：F因子最明顯的表型是編碼細(xì)胞壁外的性纖毛（sexpili），使細(xì)胞之間可以接合。大腸桿菌素（colicin）因子，簡稱col因子，帶有編碼colicin的基因。質(zhì)粒R因子上帶有抗藥性基因，其宿主表現(xiàn)出對一種或多種抗菌素或藥物的抗性。假單孢菌中有些分解性質(zhì)粒，帶有分解酶類，可降解樟腦、辛烷、甲苯和二甲苯等物質(zhì)。二、質(zhì)粒的遺傳特性4放線菌的質(zhì)粒scp不但是致育因子，同時(shí)還編碼抗生素合成基因。多數(shù)質(zhì)粒不顯示任何表型效應(yīng)，至少目前的方法和手段還測定不出來，這些質(zhì)粒稱為隱秘質(zhì)粒（crypticplasmid）,許多細(xì)菌都有，并非無功能，只是尚未發(fā)現(xiàn)。第七章、質(zhì)粒課件5蘇云金芽孢桿菌是著名的殺蟲細(xì)菌，其殺蟲晶體蛋白（Insecticidalcrystalprotein,ICP）基因在質(zhì)粒上。編碼殺蟲晶體蛋白基因多為cry，還有cyt基因不同的cry基因殺蟲活性不同對殺蟲晶體蛋白敏感的害蟲有很多種，包括：鱗翅目、鞘翅目、雙翅目等等。蘇云金芽孢桿菌是著名的殺蟲細(xì)菌，其殺蟲晶體蛋白（Insect6圖示蘇云金芽孢桿菌以色列亞種的一個(gè)大質(zhì)粒。編碼的殺蟲蛋白基因有7個(gè)，其中3個(gè)為cyt基因，4個(gè)為cry基因。圖示蘇云金芽孢桿菌以色列亞種的一個(gè)大質(zhì)粒。7第七章、質(zhì)粒課件8蘇云金芽孢桿菌形成的殺蟲晶體蛋白蘇云金芽孢桿菌形成的殺蟲晶體蛋白9蘇云金芽孢桿菌殺蟲晶體蛋白所作用的害蟲蘇云金芽孢桿菌殺蟲晶體蛋白所作用的害蟲10蘇云金芽孢桿菌殺蟲晶體蛋白所作用的蚊蟲蘇云金芽孢桿菌殺蟲晶體蛋白所作用的蚊蟲11

2、質(zhì)粒的大小，數(shù)量及復(fù)制類型質(zhì)粒的大小差別很大，在天然發(fā)現(xiàn)的質(zhì)粒中，最小的只有2.3kb,最大的質(zhì)粒200kb。質(zhì)粒在細(xì)胞中的數(shù)量決定于拷貝數(shù)，而拷貝數(shù)又決定于復(fù)制類型?？截悢?shù)是指每一細(xì)胞中的質(zhì)粒數(shù)量。F因子這類大質(zhì)粒的拷貝數(shù)只有1－2個(gè)，其復(fù)制受到嚴(yán)格的控制。而colE1質(zhì)粒的拷貝數(shù)在10－20個(gè)，證明其復(fù)制不受嚴(yán)格的控制。2、質(zhì)粒的大小，數(shù)量及復(fù)制類型12拷貝數(shù)測定：細(xì)胞中質(zhì)粒的總量/質(zhì)粒的分子量復(fù)制類型:嚴(yán)緊型（stringentcontrol）質(zhì)粒復(fù)制受嚴(yán)格的控制。如F因子松弛型（relaxedcontrol）質(zhì)粒復(fù)制不受嚴(yán)格的控制。如col因子松弛型質(zhì)粒可以用一定的實(shí)驗(yàn)手段使其拷貝數(shù)大大擴(kuò)增。如添加氯霉素方法?？截悢?shù)測定：13

3、質(zhì)粒的不親和性（Incompatibility）

不親和性是指同一細(xì)胞中的質(zhì)粒不能并存的現(xiàn)象。本質(zhì)相同的質(zhì)粒不相親和，所以質(zhì)粒分為若干個(gè)不相容群。不能共存在一個(gè)細(xì)胞中的質(zhì)粒，屬于同一不相容群，能共存的質(zhì)粒屬于不同的不相容群。3、質(zhì)粒的不親和性14

三、質(zhì)粒的分離、檢測與純化

請自學(xué)此部分內(nèi)容

三、質(zhì)粒的分離、檢測與純化

請自學(xué)此部15四、質(zhì)粒的復(fù)制和調(diào)節(jié)四、質(zhì)粒的復(fù)制和調(diào)節(jié)161、質(zhì)粒的復(fù)制

能夠獨(dú)立復(fù)制的單位稱為復(fù)制子（replicon）。質(zhì)粒的復(fù)制以θ型復(fù)制為主，有單向和雙向復(fù)制，以及滾環(huán)復(fù)制。復(fù)制所需蛋白主要來自寄主。質(zhì)粒的復(fù)制起始位點(diǎn)稱為oriV。Ori區(qū)域的功能：

A.復(fù)制起始

B.決定宿主范圍

C.決定拷貝數(shù)1、質(zhì)粒的復(fù)制

能夠獨(dú)立復(fù)制的單位稱為復(fù)制子（replico17第七章、質(zhì)粒課件18

2、質(zhì)粒復(fù)制的調(diào)節(jié)

1）、抑制物—靶位調(diào)節(jié)

調(diào)節(jié)特點(diǎn)：依賴一小段反向轉(zhuǎn)錄的RNA作為抑制物，通過與目標(biāo)RNA的互補(bǔ)結(jié)合阻止質(zhì)粒復(fù)制起始。目標(biāo)RNA可以是復(fù)制的引物，也可以是復(fù)制所需蛋白的mRNA。以ColE1質(zhì)粒為例：

大小為6.6kb,拷貝數(shù)10～20個(gè)，單向復(fù)制，完全依賴宿主的復(fù)制酶系。

2、質(zhì)粒復(fù)制的調(diào)節(jié)

1）、抑制物—靶位調(diào)節(jié)19ColE1質(zhì)粒復(fù)制需要一段RNA引物，RNAII為引物前體，需被RNaseH切割加工后才有引物活性。質(zhì)粒本身編碼2個(gè)負(fù)調(diào)節(jié)因子：

1)RNAI:是反義RNA，110bp,與RNAII5’末端互補(bǔ)，形成雙鏈結(jié)構(gòu)，不被RNaseH所識(shí)別。

當(dāng)RNAI基因突變時(shí)，ColE1質(zhì)粒的拷貝數(shù)可從20個(gè)增加至250個(gè)。

ColE1質(zhì)粒復(fù)制需要一段RNA引物，202）Rop蛋白：含有63個(gè)氨基酸，以二聚體形式增強(qiáng)和促進(jìn)RNAI和RNAII形成雙鏈。復(fù)制原點(diǎn)：RNA與DNA

的轉(zhuǎn)換處RNAII延伸至復(fù)制原點(diǎn)時(shí)，被RNaseH切割，產(chǎn)生3’-OH末端，聚合酶以此作為引物合成DNA。2）Rop蛋白：含有63個(gè)氨基酸，以二聚體形式增強(qiáng)和促進(jìn)RN21ColE1質(zhì)粒的復(fù)制調(diào)控

ColE1復(fù)制需要RNA引物RNAII，從復(fù)制原點(diǎn)上游555bp處開始轉(zhuǎn)錄。ColE1編碼2個(gè)負(fù)調(diào)節(jié)因子：Rop蛋白和反義RNA－RNAI。RNAI的轉(zhuǎn)錄起始于復(fù)制原點(diǎn)上游445bp處，轉(zhuǎn)錄方向與RNAII相反。因此，與RNAII末端111bp互補(bǔ)。Rop蛋白促進(jìn)RNAI與RNAII結(jié)合，抑制質(zhì)粒的復(fù)制。ColE1質(zhì)粒的復(fù)制調(diào)控

ColE1復(fù)制需要RN22RNAI由質(zhì)粒編碼，質(zhì)粒數(shù)量多，RNAI分子也多，有效的干擾RNAII的加工，便可抑制質(zhì)粒的復(fù)制。當(dāng)RNAI基因突變時(shí)，會(huì)增進(jìn)引物的合成和質(zhì)粒的復(fù)制。質(zhì)?？截悢?shù)可從20個(gè)左右增加至250多個(gè)。RNAI由質(zhì)粒編碼，質(zhì)粒數(shù)量多，RNAI分子也多，有效的232）、重復(fù)子－競爭結(jié)合調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)特點(diǎn)：重復(fù)子（iteron）:質(zhì)粒復(fù)制起始位點(diǎn)和復(fù)制基因（rep）附近的DNA短片段，長度為17～22bp。重復(fù)子可與復(fù)制必需的蛋白R(shí)ep競爭性結(jié)合，從而抑制質(zhì)粒的復(fù)制和拷貝數(shù)的增加。含有重復(fù)子的質(zhì)粒稱為重復(fù)子質(zhì)粒（iteronplasmid），通常含有3～7個(gè)重復(fù)子。圖5－9重復(fù)子質(zhì)粒ori區(qū)和rep基因的結(jié)構(gòu)2）、重復(fù)子－競爭結(jié)合調(diào)節(jié)24第七章、質(zhì)粒課件25

調(diào)節(jié)方式：1）轉(zhuǎn)錄自體調(diào)控（transcriptionalautoregulation），是RepA蛋白與repA啟動(dòng)子區(qū)內(nèi)的反向重復(fù)序列IR1、IR2結(jié)合而抑制RepA自身的合成的過程。2）偶聯(lián)模型（couplingmodel）由于重復(fù)子序列間的相互作用，使2個(gè)質(zhì)粒偶聯(lián)在一起，從而抑制質(zhì)粒復(fù)制的起始。

圖5－10調(diào)節(jié)方式：26第七章、質(zhì)粒課件273）、質(zhì)粒之間的不相容性不相容性是指在同一細(xì)胞中的質(zhì)粒不能共存的現(xiàn)象。目前認(rèn)為質(zhì)粒的不相容性與復(fù)制、調(diào)控和分配有關(guān)。3）、質(zhì)粒之間的不相容性28復(fù)制調(diào)控機(jī)制相同的質(zhì)粒，可能產(chǎn)生相同的阻遏物，使得它們不能在同一細(xì)胞中共存下去，則認(rèn)為屬于同一個(gè)不相容群。復(fù)制調(diào)控機(jī)制不相同的質(zhì)粒，形成各自不同的阻遏物，互不干擾，可在同一細(xì)胞中共處，則認(rèn)為屬于不同的不相容群。復(fù)制調(diào)控機(jī)制相同的質(zhì)粒，可能產(chǎn)生相同的阻遏物，使得它們不能在29五、質(zhì)粒的穩(wěn)定性

（細(xì)胞分裂中的質(zhì)粒分配）質(zhì)粒的穩(wěn)定性包括分離穩(wěn)定性和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性分離穩(wěn)定性與細(xì)胞分裂中的質(zhì)粒分配機(jī)制有關(guān)要保持質(zhì)粒的穩(wěn)定性，每一細(xì)胞世代質(zhì)粒必需復(fù)制1次，且能夠平均分配到2個(gè)子細(xì)胞中質(zhì)粒分配途徑有主動(dòng)分配和隨機(jī)分配2種方式五、質(zhì)粒的穩(wěn)定性

（細(xì)胞分裂中的質(zhì)粒分配）質(zhì)粒的穩(wěn)定性包括分301、主動(dòng)分配機(jī)制低拷貝數(shù)質(zhì)粒的穩(wěn)定性決定于2種機(jī)制。由2類基因控制。主動(dòng)分配體系par和寄主致死體系ccdpar區(qū)稱為分配區(qū)或分配座位（partitionregionorpartitionlocus）。是一段質(zhì)粒DNA序列，其功能是確保質(zhì)粒的數(shù)量均等的分配到分裂后的子細(xì)胞中。F因子的par區(qū)與復(fù)制起點(diǎn)緊密相連。有3個(gè)基因：sopA,sopB,sopC。其中sopA,sopB編碼反式作用蛋白，sopC為順式作用位點(diǎn)，也稱為類著絲粒位點(diǎn)。（圖5－13）1、主動(dòng)分配機(jī)制低拷貝數(shù)質(zhì)粒的穩(wěn)定性決定于2種機(jī)制。由2類基31sopA與sopB構(gòu)成一個(gè)轉(zhuǎn)錄單位，sopA與啟動(dòng)區(qū)域結(jié)合，控制2個(gè)蛋白的轉(zhuǎn)錄。屬自體阻遏控制。sopB蛋白起到促進(jìn)sopA與啟動(dòng)區(qū)域結(jié)合的作用。sopA、sopB缺一不可。sopC由12個(gè)正向重復(fù)序列組成，每個(gè)含有43個(gè)bp，其中又包含反向重復(fù)序列。sopA與sopB構(gòu)成一個(gè)轉(zhuǎn)錄單位，sopA與啟動(dòng)區(qū)域結(jié)合32

sopB與sopC區(qū)結(jié)合形成核酸－蛋白復(fù)合物，稱為分配復(fù)合體。分配復(fù)合體在細(xì)胞分裂時(shí)將2個(gè)質(zhì)粒移向細(xì)胞兩級。sopA與啟動(dòng)區(qū)域結(jié)合，控制2個(gè)蛋白的轉(zhuǎn)錄。sopB蛋白起到這一結(jié)合的促進(jìn)作用。sopA、sopB缺一不可。質(zhì)粒主動(dòng)分配模型見圖5－14sopB與sopC區(qū)結(jié)合形成核酸－蛋白復(fù)合物，稱為分配復(fù)33SopB與sopC區(qū)結(jié)合形成核酸－蛋白復(fù)合物，稱為分配復(fù)合體。分配復(fù)合體在細(xì)胞分裂時(shí)將2個(gè)質(zhì)粒移向細(xì)胞兩級。SopB與sopC區(qū)結(jié)合形成核酸－蛋白復(fù)合物，稱為分配復(fù)合體34寄主致死體系F因子基因組中控制寄主致死功能的基因有2個(gè)：ccdA,ccdB，屬同一個(gè)操縱子，操縱子表達(dá)屬自我調(diào)節(jié)。CcdA蛋白分子量8.3kD，是解毒劑，與CcdB蛋白特異結(jié)合，使其失效。CcdB蛋白分子量11.7kD，是毒劑蛋白，抑制DNA解旋酶活性，并可引發(fā)解旋酶誘導(dǎo)宿主染色體DNA雙鏈斷裂，破壞染色體的正確分配，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。寄主致死體系F因子基因組中控制寄主致死功能的基因有2個(gè)：c35寄主致死體系的調(diào)節(jié)在無質(zhì)粒的細(xì)胞中，起初2種蛋白濃度相同。但隨細(xì)胞分裂而逐漸稀釋。解毒劑CcdA蛋白與毒劑CcdB蛋白具有不同的穩(wěn)定性，這是導(dǎo)致細(xì)胞致死的關(guān)鍵因素。CcdA蛋白不穩(wěn)定，易被蛋白酶水解，濃度越來越低。CcdB蛋白不