SELDI蛋白質(zhì)芯片篩選差異蛋白分子的二級(jí)鑒定SELDI蛋白質(zhì)芯片篩選差異蛋白分子的二級(jí)鑒定1主要內(nèi)容：一、SELDI蛋白質(zhì)芯片技術(shù)二、差異蛋白質(zhì)電泳方法三、差異蛋白質(zhì)的二級(jí)質(zhì)譜鑒定

四、SELDI蛋白質(zhì)芯片技術(shù)發(fā)展現(xiàn)狀

五、SELDI蛋白質(zhì)芯片技術(shù)發(fā)展趨勢(shì)探討主要內(nèi)容：一、SELDI蛋白質(zhì)芯片技術(shù)2一、SELDI蛋白質(zhì)芯片技術(shù)1、定義SELDI蛋白質(zhì)芯片技術(shù)，即表面增強(qiáng)激光解吸離子化飛行時(shí)間質(zhì)譜(surface-enhancedlaserdesorption/ionization-timeofflight-massspectrometry)，是蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的一項(xiàng)新興技術(shù)，在識(shí)別特定蛋白質(zhì)表達(dá)物、蛋自質(zhì)差異分析、測(cè)定血清中小分子物質(zhì)含量方面提供了新的思路與方法。2、應(yīng)用該技術(shù)已經(jīng)逐漸應(yīng)用與臨床，目前已見(jiàn)其應(yīng)用于傳染病、腫瘤等疾病診斷篩選的臨床報(bào)道。SELDI蛋白質(zhì)芯片技術(shù)與傳統(tǒng)方法比較，SELDI技術(shù)對(duì)于5kDa以下的低分子量差異蛋白和低豐度的差異蛋白質(zhì)的檢出效果較佳，而且該技術(shù)具有高通量、上樣量低和靈敏度高等優(yōu)勢(shì)。但經(jīng)SELDI技術(shù)檢出的差異蛋自質(zhì)僅具有分子量特征，需進(jìn)一步進(jìn)行分離和準(zhǔn)確鑒定。

一、SELDI蛋白質(zhì)芯片技術(shù)1、定義SELDI蛋白質(zhì)芯片技術(shù)3二、差異蛋白質(zhì)電泳方法1、Tricine-SDS分離蛋白

Tricine-SDS是用于分子量在1-10kD的肽類的方法。根據(jù)蛋白質(zhì)亞基分子量的不同就可以分開蛋白質(zhì)。該技術(shù)最初由shapiro于1967年建立，他們發(fā)現(xiàn)在樣品介質(zhì)和丙烯酰胺凝膠中加入離子去污劑和強(qiáng)還原劑后，蛋白質(zhì)亞基的電泳遷移率主要取決于亞基分子量的大小（可以忽略電荷因素）。二、差異蛋白質(zhì)電泳方法1、Tricine-SDS分4二、差異蛋白質(zhì)電泳方法2、雙向凝膠電泳分離蛋白根據(jù)蛋白質(zhì)等電點(diǎn)和分子量差異連續(xù)進(jìn)行成垂直方向的兩次電泳。第一向?yàn)榈入娋劢闺娪?，其基本原理是利用蛋白質(zhì)分子的等電點(diǎn)不同進(jìn)行蛋白質(zhì)分離。第二向?yàn)槭榛蛩徕c-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS），是按蛋白質(zhì)分子量的大小進(jìn)行分離的，再用考馬斯亮藍(lán)或P銀進(jìn)行檢驗(yàn)，最后進(jìn)行結(jié)果對(duì)比，解析。二、差異蛋白質(zhì)電泳方法2、雙向凝膠電泳分離蛋白5三、差異蛋白質(zhì)的二級(jí)質(zhì)譜鑒定

1

4近年來(lái)，生命科學(xué)技術(shù)的創(chuàng)新和突破，尤其是質(zhì)譜技術(shù)的革新，對(duì)蛋白質(zhì)組學(xué)研究起到了關(guān)鍵的推動(dòng)作用。質(zhì)譜的數(shù)據(jù)結(jié)果是蛋白質(zhì)組與序列數(shù)據(jù)庫(kù)聯(lián)系的橋梁。質(zhì)譜（mass

spectrometry，MS）的基本原理是在樣品離子化后，根據(jù)不同離子質(zhì)荷比的不同進(jìn)行分離并確定分子量。質(zhì)譜鑒定蛋白的方法具有靈敏度高，準(zhǔn)確度高，易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)。

三、差異蛋白質(zhì)的二級(jí)質(zhì)譜鑒定146三、差異蛋白質(zhì)的二級(jí)質(zhì)譜鑒定80年代末，隨著兩種適合蛋白質(zhì)研究的軟電離方式的出現(xiàn)即電噴霧離子化（ESI）和基質(zhì)輔助的激光解析離子化（MALDI），使得質(zhì)譜應(yīng)用于生物大分子的鑒定成為可能。如今，質(zhì)譜已成為蛋白研究中最重要的鑒定技術(shù)，是后基因組時(shí)代的關(guān)鍵核心技術(shù)。這種技術(shù)的應(yīng)用范圍已經(jīng)從細(xì)胞，組織以及整個(gè)有機(jī)體中蛋白質(zhì)的表達(dá)到蛋白質(zhì)翻譯后修飾等多個(gè)方面。包括蛋白消化、上樣打點(diǎn)操作、上機(jī)檢測(cè)及質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)檢索。

三、差異蛋白質(zhì)的二級(jí)質(zhì)譜鑒定80年代末，隨著兩種適合蛋白質(zhì)研7四、SELDI蛋白質(zhì)芯片技術(shù)發(fā)展現(xiàn)狀

SELDI蛋白質(zhì)芯片技術(shù)，是用于蛋白質(zhì)組學(xué)研究的一項(xiàng)新技術(shù)，它是在MALDI基礎(chǔ)上改進(jìn)后實(shí)行表面增強(qiáng)的飛行質(zhì)譜。SELDI蛋白質(zhì)芯片技術(shù)的出現(xiàn)為蛋白質(zhì)差異分析提供了新的有力工具，目前已應(yīng)用于如多種傳染病及惡性腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)中。Schagger等用Tris-Tricine體系代替Tris-glycine體系后可很好地分離分子量在1～100kDa的蛋白質(zhì)。該方法降低了分離膠的pH值(pH8.45)，使蛋自質(zhì)的移動(dòng)速度變慢，提高了電泳分辨率；其次，解除短肽-SDS復(fù)合物與SDS顆粒的共遷移效應(yīng)，改善小分子量短肽的電泳效果。仉紅剛等研究考察該方法的靈敏度與分辨率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大致在35-70kDa范圍的蛋白(例如53kDa的微管蛋白-ɑ3)在Tricine-SDS中肉眼即能觀察到清晰的分離條帶-且重復(fù)性較理想。四、SELDI蛋白質(zhì)芯片技術(shù)發(fā)展現(xiàn)狀SELDI蛋白質(zhì)芯片8五、SELDI蛋白質(zhì)芯片技術(shù)發(fā)展趨勢(shì)探討

近年來(lái)隨著質(zhì)譜技術(shù)的不斷進(jìn)步，質(zhì)譜分辨率越來(lái)越高，蛋白鑒定的電噴霧傅立葉變換離子回旋共振高分辨質(zhì)譜也采用的是一種具有超高質(zhì)量分辨能力的新型質(zhì)譜儀，它將電噴霧離子化(ESI)技術(shù)結(jié)合于傅立葉變換離子回旋共振質(zhì)譜儀(FTICR-MS)。在離子源的電離技術(shù)上和質(zhì)量分析器上有著各自的優(yōu)缺點(diǎn)。五、SELDI蛋白質(zhì)芯片技術(shù)發(fā)展趨勢(shì)探討近年來(lái)9在離子源的電離技術(shù)上

12

ESI技術(shù)與傳統(tǒng)的電子轟擊(EI)電離、化學(xué)電離(CI)、場(chǎng)解析(FD)離子化技術(shù)及快原子轟擊(FAB)離子化技術(shù)相比，具有更適于離子性極性化合物、質(zhì)荷比小于4000、化學(xué)噪音低、容易獲得碎片離子信息、所鑒定蛋白質(zhì)分子量可達(dá)1，000，000Da等優(yōu)點(diǎn)，但其離子源結(jié)構(gòu)復(fù)雜，易受Na+、K+等金屬離子干擾，且不能用于分析非極性化合物的缺點(diǎn)仍難以避免。五、SELDI蛋白質(zhì)芯片技術(shù)發(fā)展趨勢(shì)探討在離子源的電離技術(shù)上12ESI技術(shù)與傳統(tǒng)的10在質(zhì)量分析器上

23

與磁質(zhì)譜儀、四極質(zhì)量過(guò)濾器質(zhì)譜儀、離子肼質(zhì)譜儀相比，F(xiàn)TICR-MS具有較掃描型質(zhì)譜(磁質(zhì)譜、四極桿等)高得多的靈敏度；且其感應(yīng)電流檢測(cè)離子的方式是非破壞性的，離子可繼續(xù)被儲(chǔ)存、分析，從而實(shí)現(xiàn)多級(jí)質(zhì)譜分析；具有超高分辨能力和質(zhì)量精確度(很容易實(shí)現(xiàn)幾十甚至上百萬(wàn)的分辨率，無(wú)需內(nèi)標(biāo)就能達(dá)到小于2ppm的質(zhì)量準(zhǔn)確度，是現(xiàn)有分辨率最高且質(zhì)量穩(wěn)定性較好的目前蛋白質(zhì)和肽段測(cè)序中的頂端質(zhì)譜儀。

五、SELDI蛋白質(zhì)芯片技術(shù)發(fā)展趨勢(shì)探討在質(zhì)量分析器上23與磁質(zhì)譜儀、四極111

蛋白質(zhì)芯片技術(shù)探討3

仉紅剛研究中所選兩種目標(biāo)蛋白均為分子量均大于50kDa的極性分子，因而僅從各電離技術(shù)適用的質(zhì)量范圍上即可首先對(duì)排除EI(小于1000Da)、CI(小于1000Da)、FD(小于2000Da)、FAB(200-6000Da)等的選擇，而選用所鑒定蛋白質(zhì)分子量可達(dá)1,000，000Da且尤其適于離子性極性化合物的ESI技術(shù)。五、SELDI蛋白質(zhì)芯片技術(shù)發(fā)展趨勢(shì)探討在質(zhì)量分析器的選擇上，磁質(zhì)譜儀雖堪稱經(jīng)典，但不能較好地與離子化技術(shù)連用、且體積大造價(jià)高；四極質(zhì)量過(guò)濾器質(zhì)譜儀雖體積小造價(jià)低且重復(fù)性好，但分辨率較低；離子肼質(zhì)譜儀動(dòng)態(tài)范圍窄、不便確定是否適用于目標(biāo)蛋白，且易受檢測(cè)器條件等多個(gè)儀器參數(shù)的影響因而重復(fù)性略差。故以SELDI蛋白質(zhì)