細(xì)胞破碎及多酚氧化酶的制備實(shí)驗(yàn)二細(xì)胞破碎及多酚氧化酶制備Contents多酚氧化酶的基本概況1果蔬中多酚氧化酶的褐變機(jī)理2果蔬加工中酶褐變的控制的方法3實(shí)驗(yàn)內(nèi)容4實(shí)驗(yàn)二細(xì)胞破碎及多酚氧化酶制備概念多酚氧化酶（polyphenoloxidase,PPO）是自然界中分布極廣的一種金屬蛋白酶，普遍存在于植物、真菌、昆蟲(chóng)的質(zhì)體中，甚至在土壤中腐爛的植物殘?jiān)隙伎梢詸z測(cè)到多酚氧化酶的活性。

廣義上，PPO可分為單酚氧化酶、雙酚氧化酶、漆酶植物微生物實(shí)驗(yàn)二細(xì)胞破碎及多酚氧化酶制備實(shí)驗(yàn)二細(xì)胞破碎及多酚氧化酶制備土豆的褐變實(shí)驗(yàn)二細(xì)胞破碎及多酚氧化酶制備含有兒茶酚水果的褐變實(shí)驗(yàn)二細(xì)胞破碎及多酚氧化酶制備1.植物中的多酚氧化酶在植物(如蘋果、荔枝、菠菜、馬鈴薯、豆類、茶葉、桑葉、煙草等)組織中，PPO是與內(nèi)囊體膜結(jié)合在一起的，天然狀態(tài)無(wú)活性，但將組織勻漿或損傷后PPO被活化，從而表現(xiàn)出活性。在高等植物組織發(fā)生褐變主要是PP0活動(dòng)的結(jié)果。實(shí)驗(yàn)二細(xì)胞破碎及多酚氧化酶制備2.微生物漆酶

漆酶是三大類多酚氧化酶中作用底物最廣的一類。在真菌中，漆酶大多分布在擔(dān)子菌(Basidimycetes)、多孔菌(Polyporus)、子囊菌(A-somycetes)、脈孢菌(Neurospora)、柄孢殼菌(Po-dospora)和曲霉菌(Aspergillus)等真菌中。擔(dān)子菌中的白腐菌是目前獲得漆酶的主要來(lái)源。

實(shí)驗(yàn)二細(xì)胞破碎及多酚氧化酶制備

3.微生物酪氨酸酶

酪氨酸酶，又叫單酚氧化酶，它可以氧化L-酪氨酸合成L-多巴和黑色素。在高等動(dòng)物和人類中酪氨酸酶的活性高低與黑色素的形成速率有關(guān)，缺乏此酶將引起白化病。

實(shí)驗(yàn)二細(xì)胞破碎及多酚氧化酶制備果蔬中多酚氧化酶的褐變機(jī)理實(shí)驗(yàn)二細(xì)胞破碎及多酚氧化酶制備果蔬褐變是指水果和蔬菜加工及其制品在儲(chǔ)藏過(guò)程中，產(chǎn)生果蔬組織顏色變得灰暗或變成褐色的現(xiàn)象。褐變不僅影響果蔬食品原有的色澤，而且影響其風(fēng)味和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。實(shí)驗(yàn)二細(xì)胞破碎及多酚氧化酶制備其分為二種類型的酶：①鄰二酚氧化酶（包括有兒茶酚氧化酶、多酚氧化酶）和單酚氧化酶。

多酚氧化酶催化的類型實(shí)驗(yàn)二細(xì)胞破碎及多酚氧化酶制備②對(duì)二酚氧化酶（有樹(shù)膠氧化酶、酪氨酸氧化酶）實(shí)驗(yàn)二細(xì)胞破碎及多酚氧化酶制備在果蔬中，除了具有活性的多酚氧化酶外，還有某些非活性形式或潛在形式。包括酶原形式，已在番茄和馬鈴薯中發(fā)現(xiàn)。細(xì)胞膜結(jié)合酶部分，使用離子凈化劑可增加PPO活性或激活酶本身。實(shí)驗(yàn)二細(xì)胞破碎及多酚氧化酶制備PPO的催化反應(yīng)的機(jī)理⑴酶活性中心的兩個(gè)銅原子與O2結(jié)合，以氧原子為橋，兩個(gè)氧原子仍有鍵連，酶本身由脫氧型變成含氧型。⑵含氧型酶與鄰二酚結(jié)合，二個(gè)羥基中的氧分別結(jié)合在二個(gè)銅原子上，同時(shí)釋放出2個(gè)氫離子。實(shí)驗(yàn)二細(xì)胞破碎及多酚氧化酶制備⑶酶、氧及鄰二酚形成的復(fù)合物與二個(gè)氫離子在氧橋上結(jié)合，并釋放出苯醌。⑷間氧型酶與第二個(gè)鄰二酚分子結(jié)合，結(jié)合位點(diǎn)與第一步相同，但兩個(gè)銅原子之間的一個(gè)OH基與氫離子結(jié)合，生成一分子水和一個(gè)氫離子。實(shí)驗(yàn)二細(xì)胞破碎及多酚氧化酶制備⑸間氧型酶與鄰二酚的復(fù)合物與另一個(gè)H+結(jié)合（即兩個(gè)銅原子之間的另一個(gè)OH基與結(jié)合），生成一分子水，同時(shí)釋放出第二分子的苯醌，但氧化前后二個(gè)鄰二酚的變化并不完全相同。實(shí)驗(yàn)二細(xì)胞破碎及多酚氧化酶制備含有多酚類的果蔬在多酚氧化酶的催化下，首先氧化成鄰醌；然后鄰醌或未氧化的鄰二酚在酚羥基酶催化下進(jìn)行二次羥基化作用，生成三羥基化合物；鄰醌再將三羥基化合物氧化成羥基醌；羥基醌易聚合而生成黑色素。總結(jié)：實(shí)驗(yàn)二細(xì)胞破碎及多酚氧化酶制備果蔬加工中酶褐變的控制的方法實(shí)驗(yàn)二細(xì)胞破碎及多酚氧化酶制備㈠物理控制⑴熱處理加熱是最有效的殺酶方法。瞬時(shí)高溫可在短時(shí)間鈍化酶的活性,抑制褐變。有無(wú)副作用呢？？？實(shí)驗(yàn)二細(xì)胞破碎及多酚氧化酶制備⑵低溫貯藏低溫下有效降低PPO活性,延緩呼吸高峰的出現(xiàn),控制果蔬褐變,延長(zhǎng)貨架期。⑶氣調(diào)

通過(guò)改變貯藏環(huán)境的氣體成分,減輕褐變,保持果蔬采后品質(zhì)。⑷可食膜

使果蔬內(nèi)部維持相當(dāng)于氣調(diào)的高CO2低O2狀態(tài),抑制褐變。它具有無(wú)色、無(wú)味和可食等優(yōu)點(diǎn),一般采用蛋白質(zhì)、油脂和多糖等材料,如纖維素基質(zhì)、支鏈淀粉、乳蛋白。實(shí)驗(yàn)二細(xì)胞破碎及多酚氧化酶制備㈡化學(xué)控制⑴亞硫酸鹽亞硫酸鹽是傳統(tǒng)的褐變抑制劑。但它破壞營(yíng)養(yǎng),使組織軟化并產(chǎn)生異味,且有害健康,美國(guó)FDA已對(duì)其使用做出限制。⑵4-己基間苯二酚(4-HR)

作為新型抗氧化劑，是酪氨酸酶的有效抑制劑，其化學(xué)穩(wěn)定性相當(dāng)好，安全性高，對(duì)酚酶抑制力強(qiáng)。大量實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)可抑制微生物生長(zhǎng)與果蔬褐變,延長(zhǎng)貯藏期。實(shí)驗(yàn)二細(xì)胞破碎及多酚氧化酶制備⑶1-甲基環(huán)丙烯(1-MCP)1-MCP是乙烯受體的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑,延緩了組織軟化、衰老和褐變,且無(wú)毒、用量低。⑷天然抑制劑有研究發(fā)現(xiàn)外源花青素可抑制采后荔枝果皮脂質(zhì)的過(guò)氧化反應(yīng),一定程度維持果皮組織的膜完整性,減輕褐變。實(shí)驗(yàn)二細(xì)胞破碎及多酚氧化酶制備⑸

酸處理抗壞血酸及其衍生物:抗壞血酸可還原醌類,阻止它們轉(zhuǎn)化為有色物質(zhì)，但不太穩(wěn)定，而其衍生物如抗壞血酸脂肪酸酯(如十二酸酯,葵酸,棕櫚酸抗壞血酸酯)及抗壞血酸-2-磷酸鹽也有很好的抗褐變作用?？箟难徕}已廣泛應(yīng)用于抑制鮮切果蔬褐變,取得很好效果,但其缺點(diǎn)是價(jià)格較貴。實(shí)驗(yàn)二細(xì)胞破碎及多酚氧化酶制備㈢生物技術(shù)通過(guò)對(duì)果蔬基因改良,選育抗褐變新品種,達(dá)到抑制褐變的目的。目前較成功的是反義RNA。由于生物技術(shù)可以免除繁瑣的滅酶工藝,避免使用抗氧化劑帶來(lái)的潛在隱患,具有廣闊的前景。實(shí)驗(yàn)二細(xì)胞破碎及多酚氧化酶制備關(guān)于果實(shí)酶促褐變方面的研究很多，褐變機(jī)理也比較復(fù)雜，目前尚未完全弄清。關(guān)鍵問(wèn)題集中在對(duì)PPO及其底物的研究以及采后貯藏環(huán)境對(duì)酶促褐變的影響。酶促褐變與果實(shí)衰老有密切關(guān)系，衰老過(guò)程中酶與底物的分區(qū)定位遭到破壞是導(dǎo)致酶促褐變的主要原因。PPO合成基因的表達(dá)可能與衰老有關(guān)。對(duì)PPO的深入研究有望從分子水平上搞清酶促褐變的機(jī)理，為控制酶促褐變提供新方法。展望實(shí)驗(yàn)二細(xì)胞破碎及多酚氧化酶制備改變PPO基因的表達(dá)利用反義RNA技術(shù)反向表達(dá)PPO基因，修飾轉(zhuǎn)基因植株中多酚氧化酶基因的表達(dá)，從而控制酶促褐變。目前已成功利用該技術(shù)得到了無(wú)褐變的馬鈴薯品系。除了對(duì)蘋果、梨、茶葉、小麥等作物的報(bào)道外，而且對(duì)于其它食品中的多酚氧化酶的研究也日漸豐富起來(lái)。實(shí)驗(yàn)二細(xì)胞破碎及多酚氧化酶制備實(shí)驗(yàn)內(nèi)容一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模海?）學(xué)習(xí)從植物組織細(xì)胞中制備酶的方法。（2）掌握多酚氧化酶活性的測(cè)定方法。實(shí)驗(yàn)二細(xì)胞破碎及多酚氧化酶制備二、實(shí)驗(yàn)原理

多酚氧化酶是一種含銅的酶，其最適pH值為6～7。由多酚氧化酶催化的反應(yīng)，如以鄰苯二酚為底物，可以被氧化形成鄰苯二醌。由多酚氧化酶催化的氧化還原反應(yīng)可通過(guò)溶液的顏色的變化鑒定，這個(gè)反應(yīng)在自然界中是常見(jiàn)的，如去皮的馬鈴薯和水果變成褐色就是由于該酶作用的結(jié)果。

多酚氧化酶的最適底物是鄰苯二酚（兒茶酚）。間苯二酚和對(duì)苯二酚與鄰苯二酚的結(jié)構(gòu)相似，它們也可以被氧化為各種有色物質(zhì)。實(shí)驗(yàn)二細(xì)胞破碎及多酚氧化酶制備三、試劑及器具

1、材料市售新鮮土豆2、試劑及配制0.1mol/L的NaF溶液:（將4.2g氟化鈉溶于1000ml水中）、0.01mol/L的鄰苯二酚溶液:（將1.1g鄰苯二酚溶解于1000ml水中，用稀氫氧化鈉調(diào)節(jié)溶液的pH值為6.0防止其自身的氧化作用。當(dāng)溶液變成褐色時(shí)，應(yīng)重新配制。新配制的溶液應(yīng)貯存于棕色瓶中。最好當(dāng)天配當(dāng)天用）、檸檬酸緩沖液:(pH6.0,0.05~0.1mol/L)、（0.1mol/L：檸檬酸.H2O3.7818g,檸檬酸鈉.2H2O24.124g）飽和硫酸銨溶液：（761克/1000ml水）3、器具勻漿機(jī)、小刀、紗布、燒杯、布氏漏斗、抽濾瓶、量筒、容量瓶、普通離心機(jī)、冰箱、恒溫水浴鍋。實(shí)驗(yàn)二細(xì)胞破碎及多酚氧化酶制備四、實(shí)驗(yàn)過(guò)程

（一）酶抽提物的制備1、洗去土豆上面的泥土。2、去土豆皮后切成小塊3、稱取200g土豆塊放入勻漿器中，再加入氟化鈉溶液200ml。(全班30組共用)4、在勻漿器中機(jī)械打碎30s。5、把勻漿物通過(guò)幾層細(xì)布濾入燒杯中。6、每組各自取10mL濾液，(用50mL離心管），然后在濾液中加入等體積的飽和硫酸銨溶液，混合后于4℃放置30min。7、在4000r/min下離心15min，倒掉上清液。8、將沉淀物用大約2ml檸檬酸緩沖液溶解(pH6.0,0.05~0.1mol/L)，即得該酶粗制品實(shí)驗(yàn)二細(xì)胞破碎及多酚氧化酶制備四、實(shí)驗(yàn)過(guò)程

（二）多酚氧化酶的顏色反應(yīng)：1、將3只干凈的試管編號(hào)為1、2、3。2、按下面的要求制備各管：管1：加入15滴酶抽提液和15滴0.01mol/L的鄰苯二酚溶液，混合均勻。管2：加入15滴酶抽提液和15滴水，混合均勻。管3：加入15滴0.01mol/L的鄰苯二酚溶液和15滴水，混合。3、把3只試管放于37℃水浴中。4、每隔5min震蕩試管并觀察每管中溶液顏色的變化，共反應(yīng)25min。5、觀察現(xiàn)