新兩步法與一步法檢測(cè)乙肝表面抗原的比較

2010年10月，國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局（hbsag）將hbsag的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)從步驟法改為新階段法。為做好2種試劑的更換銜接工作,筆者對(duì)一步法和新兩步法兩種試劑進(jìn)行了平行比對(duì)試驗(yàn),現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。材料和方法1血清樣品檢測(cè)從2011年2月18日~3月30日,每天抽HBsAg20,20d共對(duì)400份血清樣本進(jìn)行一步法和新兩步法的平行對(duì)照檢測(cè)。所抽取的400份血清樣本均外觀澄清透明,無(wú)溶血、脂血現(xiàn)象。2表13e抗-hbsag陽(yáng)性血清中和1/3采用廈門(mén)英科新創(chuàng)HBsAg一步法和新兩步法試劑盒,一步法試劑批號(hào)2010086119,新兩步法試劑批號(hào)2010125123。中和血清選擇能將反向間接血凝試驗(yàn)效價(jià)為1:1024的HBsAg陽(yáng)性血清中和的抗-HBs陽(yáng)性血清,而其他乙肝指標(biāo)全部陰性。HBsAg標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)GBW(E)090071購(gòu)自北京康徹斯坦生物技術(shù)公司,濃度為2IU/ml,批號(hào)201006001。普朗DNX-9620A電腦洗板機(jī)洗板,普朗DNM-9602G酶標(biāo)儀比色。3血清標(biāo)本測(cè)定每天用一步法和新兩步法同時(shí)測(cè)定抽取的20份患者血清,分別設(shè)置空白孔、陰性對(duì)照孔、陽(yáng)性對(duì)照孔和質(zhì)控孔各1孔。連續(xù)測(cè)定20d共400份血清樣本。每天記錄各血清樣本、陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照和質(zhì)控孔的A450值。陽(yáng)性臨界值(cutoff值)為0.105,s/co≥1判定為陽(yáng)性。對(duì)新兩步法和一步法檢測(cè)有分歧的血清樣本進(jìn)行中和試試驗(yàn)以排除假陽(yáng)性,進(jìn)行稀釋試驗(yàn)以排除鉤狀效應(yīng)。3.1a.nm比色法取血清50μl加入酶標(biāo)板,立即加入酶標(biāo)抗體50μl,振蕩混勻放入37℃水浴箱孵育25min,室溫平衡5min后,洗板5次,加入A液和B液各1滴,37℃顯色15min后于450/630nm比色,記錄A450nm值。3.2s150nm值的測(cè)定加入樣本稀釋液20μl,然后加入血清100μl,37℃水浴箱孵育1h后取出,直接加入酶標(biāo)抗體50μl,振蕩混勻后再次放入37℃水浴箱孵育30min,洗板5次,加入A液和B液各1滴,37℃顯色30min后于450/630nm比色,記錄A450nm值。3.3血清s/co值取血清樣本0.5ml的2份,1份加入10μl中和血清,另一份加入10μl生理鹽水,37℃水浴中和30min后,分別用一步法和新兩步法測(cè)定,計(jì)算s/co值。3.4hbsag測(cè)定將血清樣本進(jìn)行倍比稀釋至1∶1024,稀釋后的樣本分別采用一步法、新兩步法和新兩步法+加酶前洗板三種形式測(cè)定HBsAg,并計(jì)算s/co值。4法和新兩步法的一致性應(yīng)用13.0軟件。計(jì)量資料以表示。一步法和新兩步法的一致性采用i2檢驗(yàn);兩種方法檢測(cè)的血清樣本、陰陽(yáng)性對(duì)照和質(zhì)控的A450nm值的比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)。1新兩步法與一步法的差異分別對(duì)陰性和陽(yáng)性血清、陰性和陽(yáng)性對(duì)照以及質(zhì)控血清的一步法和新兩步法A450nm進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn),僅有質(zhì)控血清的A450nm的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),新兩步法檢測(cè)質(zhì)控血清的A450nm明顯高于一步法(見(jiàn)表2)。2中和試驗(yàn)的結(jié)果3步法和新兩步法的適應(yīng)證《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》中規(guī)定乙肝表面抗原檢測(cè)采用酶聯(lián)免疫(ELISA)雙抗體夾心法,但未明確標(biāo)明是用一步法還是兩步法。由于一步法操作簡(jiǎn)單快速,滿足了快速報(bào)告的要求,多年來(lái)臨床上檢測(cè)HBsAg多采用一步法,而血液中心、血站等采血機(jī)構(gòu)對(duì)獻(xiàn)血者的乙型肝炎篩查僅為乙肝表面抗原一項(xiàng)。由于ELISA一步法的特異性和敏感度問(wèn)題而導(dǎo)致HBV感染漏檢,是造成輸血性和醫(yī)源性HBV感染的主要原因。ELISA中一步法的反應(yīng)時(shí)間短,可能導(dǎo)致弱陽(yáng)性標(biāo)本因反應(yīng)不完全使靈敏度降低而造成漏檢,另一方面由于鉤狀效應(yīng)(hookeffect),對(duì)于陽(yáng)性標(biāo)本來(lái)說(shuō),若抗原濃度過(guò)高,過(guò)量的抗原會(huì)分別與固相抗體和液相酶標(biāo)抗體結(jié)合,而無(wú)法形成能夠顯色的抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物,使強(qiáng)陽(yáng)性標(biāo)本顯色變淺甚至漏檢。因此2010年10月SFDA將臨床常用的(30+15)min的一步法模式,變更為(60+30+30)min的新兩步法模式,而且絕大多數(shù)新兩步法模式為血清溫育1h后不洗板直接加酶的方式,既延長(zhǎng)了抗原抗體反應(yīng)時(shí)間也延長(zhǎng)了顯色時(shí)間,以期望提高ELISA檢測(cè)的靈敏度,并能降低HOOK效應(yīng)。筆者分別采用一步法和新兩步法對(duì)400份標(biāo)本進(jìn)行為期20d的平行對(duì)照試驗(yàn),一步法和新兩步法具有較好的一致性,7份陽(yáng)性血清中有3份為真陽(yáng)性而4份為假陽(yáng)性。提示新兩步法較一步法更加敏感,但也增加了假陽(yáng)性率,需引起檢驗(yàn)人員的重視。從表3和圖1中對(duì)1號(hào)樣本稀釋試驗(yàn)的數(shù)據(jù)分析結(jié)果看,一步法的樣本s/co值為0.987,可判定為陰性;新兩步法的s/co值為5.879,則判定為陽(yáng)性結(jié)果,且進(jìn)行稀釋試驗(yàn)時(shí),s/co值隨著稀釋倍數(shù)的增加出現(xiàn)先升高后降低的現(xiàn)象,該實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象說(shuō)明1號(hào)樣本是由HOOK效應(yīng)引起的,可見(jiàn)新兩步法在一定程度上能克服部分HOOK效應(yīng),避免漏檢。而進(jìn)一步采用新兩步法+加酶前洗板的操作步驟后,該血清樣本的s/co值為最高值,且隨著血清稀釋倍數(shù)的增加,s/co值逐漸下降至與其他兩種操作基本一致,說(shuō)明新兩步法+加酶前洗板的操作步驟較有效地克服了HOOK效應(yīng)。引起這些現(xiàn)象可能是因?yàn)榭乖贵w反應(yīng)是一個(gè)動(dòng)態(tài)過(guò)程,新兩步法在血清與微孔板反應(yīng)完成后,沒(méi)有洗板而直接加入了酶標(biāo)抗體,血清中過(guò)量的抗原仍然會(huì)影響夾心復(fù)合物的形成。為此筆者改動(dòng)了新兩步法標(biāo)準(zhǔn)操作,在加入酶標(biāo)抗體前進(jìn)行了5次洗板,即當(dāng)血清與微孔板反應(yīng)結(jié)束后,洗掉了多余的抗原后HOOK效應(yīng)才被較好地克服。同時(shí)中間加入了洗板程序后,樣本、陰陽(yáng)性對(duì)照和質(zhì)控血清等各孔的A450nm值均有不同程度的增加,其原因有兩方面:一方面是在中間洗板過(guò)程的同時(shí)也洗滌掉了樣本稀釋液,而樣本稀釋液起著抑制非特異性反應(yīng)、促進(jìn)特異性反應(yīng)的作用;另一方面洗板后加入酶標(biāo)抗體,相對(duì)于直接在100μl血清+20μl稀釋液中加入酶標(biāo)抗體來(lái)說(shuō),酶的濃度增加了,也會(huì)引起最后的顯色反應(yīng)顏色加深。由于本實(shí)驗(yàn)僅對(duì)英科新創(chuàng)試劑進(jìn)行觀察,因此這方面的推論還需要進(jìn)一步增加更多的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。第一步法和新兩步法中和試驗(yàn)連續(xù)20d對(duì)20份血清樣本同時(shí)進(jìn)行一步法和新兩步法檢測(cè),兩種方法檢測(cè)HBsAg的一致性較好,見(jiàn)表1。對(duì)7份一步法檢測(cè)的陰性,而新兩步法檢測(cè)陽(yáng)性的血清樣本分別用一步法和新兩步法進(jìn)行中和試驗(yàn),同時(shí)做樣本對(duì)照。其中1~3號(hào)樣本經(jīng)中和試驗(yàn)后,一步法和新兩步法檢測(cè)的s/co值明顯下降,而4~7號(hào)樣本的s/co值沒(méi)有明顯變化(見(jiàn)表3)。對(duì)7份一步法檢測(cè)的s/co<