實驗4、細胞的傳代培養(yǎng)與凍存實驗目的】掌握無菌操作技術。掌握傳代細胞的培養(yǎng)的一般方法與步驟。掌握培養(yǎng)細胞的消化方法。了解在倒置相差顯微鏡下觀察培養(yǎng)細胞的形態(tài)和生長狀況。【實驗原理】細胞系(CellLine)與細胞株(CellStrain)的概念細胞系：初代培養(yǎng)物開始第一次傳代培養(yǎng)后的細胞，即稱之為細胞系。如細胞系的生存期有限，則稱之為有限細胞系(FiniteCellLine)；已獲無限繁殖能力能持續(xù)生存的細胞系，稱連續(xù)細胞系或無限細胞系(InfiniteCellLine)。無限細胞系有的只有永生性(或不死性)，但仍保留接觸抑制和無異體接種致癌性；有的不僅有永生性，異體接種也有致瘤性-惡性轉化細胞transformedcellLine細胞株(CellStrain):從一個經過生物學鑒定的細胞系用單細胞分離培養(yǎng)或通過篩選的方法由單細胞繁殖形成的細胞群，具有特殊性質或標志物。細胞株的特殊性質或標志必須在整個培養(yǎng)期間始終存在。由原細胞株進一步分離培養(yǎng)出與原株性狀不同的細胞群亦可稱傳代培養(yǎng)的概念體外培養(yǎng)的原代細胞或細胞株要在體外持續(xù)地培養(yǎng)就必須傳代，以便獲得穩(wěn)定的細胞株或得到大量的同種細胞，進行下一步的實驗并維持細胞種的延續(xù)。當細胞生長達到一定密度后，都需要做傳代處理，傳代的頻率或間隔與培養(yǎng)液的性質、接種細胞的數量和細胞增殖速度有關。所謂細胞“一代”，即從細胞接種到分離再培養(yǎng)的一段時間(細胞由原培養(yǎng)瓶內分離稀釋后傳到新的培養(yǎng)瓶的過程稱為傳代，進行一次分離再培養(yǎng)稱之為傳一代)，如某一細胞系為50代即該細胞已傳代50次。為亞株(substrain)。貼壁型細胞與懸浮型細胞貼壁型細胞：附著在某一固相支持物表面才能生長的細胞。圓形的細胞——貼壁-—-鋪展一一有絲分裂一一對數生長期。一一致密的細胞單層，叫做單層細胞(單層細胞培養(yǎng))?一一表面相互接觸時，就停止分裂增殖。懸浮型細胞:不必附著于固相支持物表面，而在懸浮狀態(tài)下即可生長的細胞。半懸浮生長細胞傳代：此類細胞部分呈現貼壁生長現象，但貼壁不牢，可用直接吹打法使細胞從瓶壁脫落下來，進行傳代。什么時候傳代？一般生長穩(wěn)定的細胞2~3天或4?5天傳代一次。傳代方法懸浮生長細胞傳代離心法傳代：離心(1000轉/分)去上清，沉淀物加新培養(yǎng)液后再混勻，分別加入到幾個培養(yǎng)瓶中，補充完全培養(yǎng)基。直接傳代法：用吸管直接輕輕吹打細胞懸液，將細胞懸液分別轉移到幾個培養(yǎng)瓶中，補充完全培養(yǎng)基。半懸浮生長細胞傳代此類細胞貼壁不牢，可用直接吹打法使紉胞從瓶壁脫落下來，進行傳代。貼壁生長細胞傳代采用酶消化法傳代。常用的消化液有0.25%的胰蛋白酶液。細胞凍存在低于-70°C的超低溫條件下，由機體內部的生化反應極其緩慢，甚至終止，因此采用適當的方法將生物材料降至超低溫條件，即可使生命活動固定在某一階段而不衰老死亡。當以適當的方法將凍存的生物體恢復至常溫時，其內部的生化反應可恢復正常。冷凍保存就是將體外培養(yǎng)物懸浮在加有或不加冷凍保存液的溶液中，以一定的冷凍速率降至零下某一溫度，并在此溫度下對其進行長期保存的過程。水在低于零度的條件下一結冰一細胞死亡如向培養(yǎng)液加入保護劑，可使冰點降低。在緩慢的凍結條件下，能使細胞內水份在凍結前透出細胞。貯存在一130C以下的低溫中能減少冰晶的形成。目前常用的保護劑為二甲亞砜（DMSO）和甘油，它們對細胞無毒性，分子量小，溶解度大，易穿透細胞。最適冷凍速度：不同細胞的最適冷凍速度不同。標準冷凍的開始速度為一1至一2度/min，當溫度低于一25度時，可加速，到一80度時可直接加入液氮中（一196度）。復蘇細胞時則直接將細胞的凍存管放到40度熱水中迅速解凍。通常米用4度10分一-20度30分一-80度過夜一液氮罐（或棉花包好細胞-80過夜一液氮罐）【實驗儀器、材料、試劑及用品】一.儀器：超凈工作臺、CO2培養(yǎng)箱、倒置相差顯微鏡二．材料：細胞人宮頸癌HeLa細胞人胃癌BGC-823細胞三?試劑：胰酶、DMEM培養(yǎng)基、血清、DMS0、抗生素四.用品：培養(yǎng)瓶，試管，移液管，巴斯德吸管，廢液缸，75％酒精棉球，酒精燈【實驗步驟】1?準備：超凈工作臺紫外線處理30分鐘，用肥皂洗手，穿鞋套，用新潔爾滅溶液拭擦雙手消毒。2?倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，確定細胞是否需要傳代及細胞需要稀釋的倍數。將培養(yǎng)用液置室溫下預熱。3.關閉超凈臺紫外燈，打開可見光燈開關,打開抽風機清潔空氣，除去臭氧。用75%酒精擦雙手消毒。4?正確擺放超凈臺內的實驗用品：酒精燈、酒精棉球、新潔爾滅紗布、試管架、滴管筒（頭）、吸管筒（頭）、廢液缸等。點燃酒精燈，準備好實驗試劑：DMEM培養(yǎng)基（其中血清含量10%）、血清、胰酶等。5?點燃酒精燈；取出無菌試管，巴士德吸管和刻度吸管；安上橡皮頭；過酒精燈火焰略燒后插在無菌試管內。6?將培養(yǎng)用液（90mL）瓶口用75%酒精消毒，過酒精燈火焰后斜置于酒精燈旁的架子上。打開血清（10.5mL）瓶，瓶口過酒精燈火焰后斜置于酒精燈旁的架子上。&無菌吸取10mL血清加入到培養(yǎng)液（90mL）中，用微量移液器加入雙抗100“L輕輕混勻,配置完全培養(yǎng)基。在血清中（剩余0.5mL）加入4mL完全培養(yǎng)基輕輕混勻，加入0.5mLDMSO（凍存保護劑），輕輕混勻即為凍存液。細胞瓶口靠近火焰打開瓶蓋并在酒精燈上燒口消毒，倒掉或吸出培養(yǎng)基（對于小口的培養(yǎng)瓶可采用傾倒方法，對于培養(yǎng)皿，必須用吸管吸出）加一滴管胰酶輕輕漂洗一下細胞，棄胰酶，再加入一滴管或兩滴管胰酶（以蓋住細胞量為準，轉動培養(yǎng)瓶，使其濕潤整個細胞層，蓋好瓶蓋。顯微鏡下觀察細胞的消化狀態(tài)，待細胞大部分收縮、突起、一半變圓，細胞邊界清晰時,即可立起或翻轉培養(yǎng)瓶停止消化，在超凈臺內靠近火焰處棄胰酶加兩滴管（約1.8-2mL）凍存液既全面吹打細胞瓶壁，吹打均勻，細胞濃度宜大，3X106個/mL左右。將細胞懸液吸至凍存管中，擰好蓋，封好膠布，并標記好細胞種類，凍存時間，保存條件以及凍存者姓名等（懸浮細胞凍存將細胞離心后再加凍存液）在培養(yǎng)瓶（殘余少量細胞）中加入5mL完全培養(yǎng)及，蓋好瓶蓋（擰緊后并旋回半圈）。做好記錄，倒置相差顯微鏡下觀察細胞的形態(tài)，放入C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)。16?凍存管在4度以下存放30min,轉放到一20度1.5—2h，再轉到一70度4—12h后即可轉移到液氮內，注意做好凍存記錄?！咀⒁馐马棥堪盐蘸脗鞔鷷r機，80-90%匯合度階段最好，過早細胞產量少，過晚細胞健康狀態(tài)不佳消化時間要適度，過短細胞不易脫落，過長細胞可脫落流失。消化液濃度要適宜，過濃時消化作用強烈，細胞反應快，所需消化時間短，掌握不好,細胞易流失。不同細胞對消化反應不同。貼壁不牢一直接吹下一細胞損傷【實驗結果】傳代之前的細胞 傳代之后的細胞思考題】試述傳代培養(yǎng)的步驟和注意事項，并指出哪些是關鍵步驟？細胞胞傳代培養(yǎng)的目的是什么？答：防止細胞增殖過度、營養(yǎng)枯竭、酸中毒維持細胞種的延續(xù) 將細胞種保存下去的方法。利用培養(yǎng)細胞進行各種實驗。貼壁細胞和懸浮細胞傳代方法上有什么不同？貼壁生長細胞傳代常采用酶消化法傳代。常用的消化液有0.25%的胰蛋白酶液。懸浮細胞采用以下方法：離心法傳代：離心（1000轉/分）去上清，沉淀物加新培養(yǎng)液后再混勻，分別加入到幾個培養(yǎng)瓶中，補充完全培養(yǎng)基。直接傳代法：用吸管直接輕輕吹打細胞懸液，將細胞懸液分別轉移到幾個培養(yǎng)瓶中，補充完全培養(yǎng)基。一般生長穩(wěn)定