蘇云金芽孢桿菌發(fā)酵清液工藝條件優(yōu)化研究

氨基乙醇菌是國內(nèi)外最常見的寄生蟲。它主要用于預(yù)防和處理農(nóng)業(yè)、牧場和其他領(lǐng)域的害蟲。隨著人們對綠色食品的日益青睞,它的應(yīng)用范圍越來越廣,據(jù)報道采用蘇云金芽孢桿菌殺蟲劑與磷化鋁混配防治酒曲害蟲,殺蟲的效果比單一用磷化鋁效果好。它的主要?dú)⑾x活性成分是伴孢晶體蛋白,是在菌體形成芽孢的同時形成的,正常情況下一個菌體可產(chǎn)生一個伴孢晶體蛋白。因此,如何充分利用企業(yè)中現(xiàn)有的設(shè)備和條件,延長對數(shù)期增加菌體量是提高產(chǎn)品產(chǎn)量和品質(zhì)的關(guān)鍵點(diǎn)。現(xiàn)行的生產(chǎn)方法主要是分批液體發(fā)酵法生產(chǎn),對Bt不斷深入的研究和生產(chǎn)水平不斷的提高,分批發(fā)酵法生產(chǎn)水平逐漸達(dá)到了極限,本實驗通過對培養(yǎng)基及發(fā)酵工藝的改進(jìn)在保持單位效價不變,降低非有效組份的含量以提高產(chǎn)品和品質(zhì)。1材料和方法1.1蘇云金蘑菇1.2基本培訓(xùn)1.3實驗設(shè)備1.4發(fā)酵劑發(fā)酵實驗1.4.1發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化實驗通過預(yù)試驗、單因子試驗,確定葡萄糖、蛋白胨、酵母水溶性浸出物3個因子,葡萄糖、蛋白胨取6個水平,酵母水溶性浸出物取4個水平,進(jìn)行發(fā)酵,研究Bt生產(chǎn)的適宜培養(yǎng)配方(見表1)。搖瓶培養(yǎng)發(fā)酵,在培養(yǎng)24h和38h取樣涂片觀察生理形態(tài)、測量酸堿度和濕菌重。得適宜培養(yǎng)基的配方為:4%葡萄糖,4%蛋白胨,2.5%酵母水溶性浸出物,0.5%無機(jī)鹽。1.4.2工藝條件改進(jìn)實驗1.4.2.1溶解氧最低控制量的實驗發(fā)酵周期中使用恒攪拌轉(zhuǎn)速培養(yǎng),在對數(shù)中后期溶解氧有兩三個小時的時間處于極低狀態(tài),此時分別通過調(diào)節(jié)攪拌速度使溶解氧最低值控制在1.5%、3.0%、4.5%三個濃度水平,18h取樣測菌體濕重,34h取樣測定生物效價和晶體含量。1.4.2.2培養(yǎng)溫度影響實驗方案A控制培養(yǎng)溫度27℃,恒溫培養(yǎng);方案B控制培養(yǎng)溫度30℃,恒溫培養(yǎng);方案C控制培養(yǎng)1-20h溫度30℃,20h后33℃培養(yǎng),從8h至26h每兩個小時取樣測量菌體濕重,并觀察伴孢晶體80%脫落時結(jié)束培養(yǎng),取樣檢測生物效價和晶體含量并計培養(yǎng)周期。比較各方案的差異。1.4.2.3補(bǔ)料發(fā)酵實驗配10L培養(yǎng)基,含4%葡萄糖,4%蛋白胨,2.5%酵母水溶性浸出物,0.5%無機(jī)鹽混合液在微型全自動發(fā)酵罐中120℃實罐來滅菌30min,30℃恒溫培養(yǎng),控制攪拌轉(zhuǎn)速使溶解氧水平不低于3.0%。在13h時補(bǔ)加2%和4%的葡萄糖液,測量24h時的菌體濕重,在伴孢晶體80%脫落時結(jié)束培養(yǎng),取樣檢測生物效價、還原糖和晶體含量。比較其差異。1.4.3發(fā)酵罐發(fā)酵實驗配10L培養(yǎng)基,含4%葡萄糖,4%蛋白胨,2.5%酵母水溶性浸出物,0.5%無機(jī)鹽混合液在微型全自動發(fā)酵罐中120℃實罐來滅菌30min,按一定接種量將種子接入培養(yǎng)基中,在一定的溫度下進(jìn)行培養(yǎng),300r/min,培養(yǎng)時間35h。1.4.4pH的測定1.4.5生理形態(tài)觀察方法:1600倍光學(xué)顯微鏡觀察1.4.7伴孢晶體含量測定2.1不同發(fā)酵時間條件下溶解氧的變化本試驗在發(fā)酵過程設(shè)計了3個溶解氧的最低濃度水平,18h取樣測菌體濕重,34h取樣測定生物效價和晶體含量。試驗結(jié)果列于表2和圖1。比較在這3個濃度下發(fā)酵生長的菌體濕重和晶體重,發(fā)現(xiàn)發(fā)酵。過程控制溶解氧不低于3.0%,此時對整個發(fā)酵過程動力能耗最低。因溶解氧的水平對殺蟲效果有高達(dá)13%的影響,過低造成菌體生長不良,菌體及晶體含量偏少,而過高造成能耗過大。從溶解氧曲線可知:如在發(fā)酵周期中使用恒速攪拌培養(yǎng),在對數(shù)生長前期溶解氧水平較高,而進(jìn)入中后期有兩三個小時的時間溶解氧處于極低狀態(tài)。因此,可采取在發(fā)酵過程中使用變速攪拌法進(jìn)行培養(yǎng),在對數(shù)前期用較低的攪拌轉(zhuǎn)速進(jìn)行攪拌,進(jìn)入到對數(shù)中后期溶解氧處于極低狀態(tài)時,采用大幅度提升攪拌轉(zhuǎn)速以增加發(fā)酵液中的溶解氧,然后再降低攪拌轉(zhuǎn)速。不同的發(fā)酵罐只需要幾次實驗就可測得最佳實際攪拌轉(zhuǎn)速。2.2發(fā)酵溫度對發(fā)酵的影響本試驗采用了3個方案進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng),試驗結(jié)果如表3、表4、圖2。從表3和表4發(fā)現(xiàn)方案C在菌體培養(yǎng)時間18h時,菌體濕重達(dá)到最高點(diǎn),培養(yǎng)周期最短。(圖3)這是因為菌體的生長與培養(yǎng)溫度成正比,溫度高生長快,溫度低生長慢,而發(fā)酵后期是形成芽孢階段,提高溫度有利于晶體的形成。不適宜的培養(yǎng)溫度不但使培養(yǎng)周期大大增長,因其太慢的菌量增值速度對后期的伴孢晶體的合成也產(chǎn)生了很大的影響,在中后期提升培養(yǎng)溫度可以縮短培養(yǎng)周期搞高設(shè)備周轉(zhuǎn)率。故選擇培養(yǎng)1～20h時培養(yǎng)為溫度30℃,20h后培養(yǎng)溫度為33℃作為最佳培養(yǎng)溫度。2.3補(bǔ)加2%葡萄糖液對發(fā)酵周期的影響本試驗采用優(yōu)化后的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),在13h時采用了兩種濃度進(jìn)行補(bǔ)料發(fā)酵,試驗結(jié)果表5。從試驗過程得到的結(jié)果是:補(bǔ)加2%葡萄糖液對生物效價和晶體含量都有比較大的提高,且在培養(yǎng)過程中沒有發(fā)生反饋抑制現(xiàn)象,補(bǔ)加4%葡萄糖液使發(fā)酵周期增加了4h,在對數(shù)中后期pH回升困難,發(fā)酵結(jié)束后殘余還原糖也比較高,可能是因為產(chǎn)生一定的抑制作用,生物效價與晶體含量均無明顯提高。故以補(bǔ)糖量控制在2%為最佳量。2.41補(bǔ)加2%葡萄糖選用優(yōu)化后的培養(yǎng)基配方,接種量為1%,發(fā)酵29h,培養(yǎng)對數(shù)中期補(bǔ)加2%葡萄糖。培養(yǎng)條件:1～20h溫度30℃,20h后33℃培養(yǎng);溶解氧大于3%,使發(fā)酵液生物效價達(dá)到5200IU/uL的水平,發(fā)酵液外觀粘度比常規(guī)法生產(chǎn)的發(fā)酵液要好很多,表觀性更好。3糖酸發(fā)酵3%氧合物對于提高蘇云金桿菌的產(chǎn)量可以通過改進(jìn)發(fā)酵條件來獲得。經(jīng)本試驗研究,確定了發(fā)酵最佳條件:溶解氧大于3%,培養(yǎng)溫度:1～20h為30℃,20h后33℃培養(yǎng);發(fā)酵中期補(bǔ)加2%的糖量,發(fā)酵29h。在此條件下,進(jìn)行發(fā)酵可使發(fā)酵液生物效價達(dá)到5200IU/uL的水平,制得干粉生物效