拮抗石榴枯萎病病原甘薯長蠕殼生防真菌的篩選

甘薯是一種廣泛分布于甘薯、咖啡、甘薯、芋頭等30多種木本植物的疾病。這主要是由于甘薯、李子和豆類的黑斑疹、石榴萎縮和芋頭的黑腐病。目前,我國每年因黑斑病造成的甘薯產量損失達5%~10%,并且其主要防治藥劑多菌靈、甲基硫菌靈已引起耐藥性及交互抗性。我國石榴枯萎病先后發(fā)生于云南蒙自縣、四川攀西及會理,2003年蒙自萬畝石榴園病株率達11.2%,Huang于2008年報道蒙自芋頭黑腐病病原菌甘薯長喙殼。目前,尚未發(fā)現(xiàn)良好的田間應用農藥,而生防菌枯草芽孢桿菌YZS-B15、熒光假單胞菌YZS-Ph02組合及HB在盆栽實驗中展現(xiàn)出相近的效果,由此可見,土著微生物在植物病害的防治中具有更好的應用前景。研究表明,土壤根際微生物與植物生長具有密切的聯(lián)系,一些微生物能在植物體根系周圍形成一個保護屏障作用,釋放難溶礦質中的營養(yǎng)元素以及產生促生、抗菌的次級代謝產物,對植物的發(fā)育、生長、抗病具有促進效果。本研究以分離自蒙自石榴枯萎病、芋頭黑腐病的病原菌甘薯長喙殼為指示菌,采用平板對峙生長法從石榴根際土壤篩選拮抗真菌,旨在為蒙自甘薯長喙殼病害的防治及病壤的生物修復提供菌株來源。1材料和方法1.1馬鈴薯yp1和龍血樹紫斑病石榴枯萎病甘薯長喙殼XAS-1由本課題組分離自云南蒙自新安所小寨村病干,芋頭黑斑病甘薯長喙殼菌YP1由云南農業(yè)大學植物病理學重點實驗室黃瓊教授惠贈,另有小桐子果腐病Bgf-1、芒果果腐病Mg-1、也門鐵葉斑病Ymt-2和龍血樹紫斑病Lzb-6(尚未發(fā)表資料),均由本課題組分離自紅河州。上述菌株保存在紅河學院植物病原菌鑒定及防治實驗室。1.2方法1.2.1采樣點樣點土樣的采集選擇云南蒙自新安所小寨村約0.2hm2樣地,該樣地中有一排水溝,一側約80%的石榴死亡或枯萎,一側生長旺盛。在排水溝兩側以“S”布點采樣,各取5點,采樣深度15~20cm(靠近石榴須根系1cm處),每個樣點取土樣約30g[8〗。于2011年9月、2012年4月、2012年8月各采樣1次。將土樣粉碎混勻,用100目的篩子除去沙粒、枝葉碎屑等,每份取10g碎土樣依次稀釋為10-2、10-3、10-4、10-5稀釋液;然后各取30μL涂布在PDA培養(yǎng)基上,28℃恒溫培養(yǎng)3~5d,挑取不同形態(tài)菌絲或分生孢子轉接28℃培養(yǎng)3~5d,然后鏡檢,若不純則繼續(xù)純化直至獲得純培養(yǎng)菌株。1.2.2抗菌材料檢測初篩時用打孔器取直徑為5mm的病原菌餅于PDA平板中央,再分別取直徑為5mm的土壤真菌純菌株點接在距病原菌3cm處,每個平板接6株不同菌株,呈正六邊形。28℃培養(yǎng)5~7d后觀察是否有抑菌帶或病原菌菌絲死亡、消減,具備上述現(xiàn)象者即為拮抗菌株。抑菌率測定時,方法類上,采取“三點接種法”,每個拮抗菌株3個重復,以無菌培養(yǎng)基餅作為對照。28℃恒溫培養(yǎng)3~4d后測量病原菌與拮抗菌株間的抑菌帶寬。1.2.3脂培養(yǎng)基誘導產孢真菌鑒定產孢菌株直接鑒定,不產孢真菌則利用光照、改良番茄汁瓊脂培養(yǎng)基誘導產孢[9〗,然后觀察并測量、記錄真菌的菌落特征及菌絲、分生孢子、分生孢子梗等微觀特征,然后根據魏景超《常見真菌鑒定手冊》[10〗及相關文獻鑒定到屬。2結果與分析2.1不同施肥期、不同生長植株根際土壤真菌的多樣性先后從健康石榴根際土壤分離真菌56株、患病石榴根際土壤分離真菌43株,共分離99株(表1)。結果表明,健康植株的根際土壤真菌比病株根際土壤真菌的多樣性高,健康植株根際土壤真菌在施肥后的石榴發(fā)芽期較為豐富,而患病植株根際土壤真菌隨時間推移日趨豐富。這可能是因為春季土壤經施肥和上一年度樹葉腐爛后有機質含量增加促進健康植株根際真菌的繁殖,從而增強僅有一排水溝之隔的健康植株抵御甘薯長喙殼侵染的能力;病害植株雖未經施肥,但隨著石榴發(fā)病程度加重導致的根系腐爛程度日益嚴重,為主要分解纖維素為生的真菌繁殖提供了營養(yǎng)。2.2抗菌材料對甘薯長酵母菌抗氧化能力的影響如表2所示,從99株土壤真菌中篩選到5株石榴枯萎病甘薯長喙殼拮抗菌,其中4株分離自健康植株根際土壤,3株拮抗芋頭黑腐病甘薯長喙殼,HCAF-19、HCAF-02對兩種甘薯長喙殼的抑菌能力較強,但5株拮抗菌對其他4株病原菌均無拮抗活性。2.3菌落、病原菌及菌株的初分分析拮抗菌株在PDA上均不產孢,經光照和番茄汁瓊脂培養(yǎng)基(TCJ)誘導,全光照或12h間歇光照能促進HCAF-33、DCAF-42產孢,5株拮抗菌在全光照、12h間歇光照、全黑暗等3種條件下的TCJ培養(yǎng)基上均能產孢。HCAF-02:在PDA、TCJ上菌落均中央黑色、邊緣白色,致密,背面藍黑色;菌絲黑色,有隔,分枝;分生孢子由無色的特化菌絲斷裂形成,表面光滑,無隔,棍棒狀或短桿狀。HCAF-19:在PDA、TCJ上菌落正、背面均呈白色,邊緣不整齊,呈蓮花狀輪紋,稀疏;菌絲白色,有隔,分枝;分生孢子梗明顯分化,散生,其上輪生產孢瓶梗;分生孢子黑色,無隔,橢圓形或圓形,平均直徑7.58μm。HCAF-33:在PDA、TCJ上菌落正面均呈白色或黃褐色,毯狀,致密;菌絲白色,有隔,分枝;分生孢子梗對生,其上著生對生的小瓶梗,瓶梗上單生分生孢子;分生孢子淡黃色,無隔,球形,平均直徑8.86μm。HCAF-54:在PDA、TCJ上菌落正面均呈黑色、背面藍黑色,平鋪生長,致密;菌絲黑色,有隔,分枝;分生孢子梗簇生,褐色,頂部彎曲;分生孢子褐色,無隔,短桿狀。DCAF-42:在PDA、TCJ上菌落正面均呈白色,平鋪生長,致密;菌絲黑色,有隔,分枝;分生孢子梗頂部膨大為橄欖形頂囊,頂囊上著生葡萄串狀的產孢細胞,產孢細胞全壁芽生式產孢;分生孢子綠色,無隔,橢圓形。根據菌落、菌絲、分生孢子梗及孢子形態(tài),結合《真菌鑒定手冊》[10〗,可以初步確定菌株HCAF-02為節(jié)卵孢屬(Oosporasp.);菌株HCAF-19為輪枝孢屬(Verticilliumsp.);菌株HCAF-33為木霉屬(Trichodermasp.);菌株HCAF-54為褐孢霉屬(Fulviasp.);菌株DCAF-42為葡孢霉屬(Botryosporiumsp.)。3甘薯黑斑病甘薯長論檢測菌株的基因型鑒定本試驗從30份石榴根際土樣中分離到99株真菌,篩選到拮抗石榴枯萎病病原菌甘薯長喙殼的生防菌五株,分別是:HCAF-02節(jié)卵孢屬(Oosporasp.)、HCAF-19輪枝孢屬(Verticilliumsp.)、HCAF-33木霉屬(Trichodermasp.)、HCAF-54褐孢霉屬(Fulviasp.)、DCAF-42葡孢霉屬(Botryosporiumsp.);其中菌株HCAF-02節(jié)卵孢屬(Oosporasp.);HCAF-19輪枝孢屬(Verticilliumsp.);HCAF-54褐孢霉屬(Fulviasp.)同時拮抗分離自芋頭黑腐病的病原菌甘薯長喙殼。菌株HCAF-02、HCAF-19具有高拮抗活性,具備防治蒙自石榴、芋頭甘薯長喙殼病害的應用前景。分離自石榴、芋頭的甘薯長喙殼中國菌株具有高度一致的基因同源性,均能跨寄主侵染,而甘薯黑斑病甘薯長喙殼具有