lnc-NONHSAT074080調(diào)控靶基因ARL6IP4參與RA-UIP發(fā)病的機(jī)制研究

劉媛，魯芙愛(ài)，王樂(lè)，楊有國(guó)，李小芬，肖運(yùn)平類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）是一種以關(guān)節(jié)侵蝕破壞為主要特征的系統(tǒng)性自身免疫病，間質(zhì)性肺疾?。↖LD）是RA最常見(jiàn)的系統(tǒng)受累表現(xiàn)，也是導(dǎo)致RA患者死亡的主要原因［1］。普通型間質(zhì)性肺炎（UIP）是RAILD常見(jiàn)的病理類型之一，以肺組織結(jié)構(gòu)明顯破壞和廣泛纖維化為特征，與特發(fā)性肺纖維化的表現(xiàn)和預(yù)后相似，是RA-ILD預(yù)后較差的病理類型［2］。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNA）是長(zhǎng)度大于200個(gè)核苷酸的非編碼RNA，參與細(xì)胞分化、免疫調(diào)控、組織纖維化等重要的生物學(xué)功能，從多層面調(diào)控基因的表達(dá)，參與疾病發(fā)生發(fā)展，為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。lncRNA的表達(dá)或功能障礙與遺傳性疾病、自身免疫性疾病及腫瘤密切相關(guān)［3-4］。lncRNA在多種纖維化組織中存在特異性的表達(dá)譜，被認(rèn)為是纖維化的功能調(diào)節(jié)器，某些差異表達(dá)的lncRNA在肺纖維化的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的調(diào)控功能［5］。然而，lncRNA在RA-UIP發(fā)病中的具體作用及機(jī)制尚不清楚。本研究通過(guò)基因芯片篩選RA-UIP患者全血中表達(dá)上調(diào)的lncRNA，并采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qPCR）檢測(cè)驗(yàn)證，同時(shí)從細(xì)胞水平驗(yàn)證目標(biāo)lncRNA與肺纖維化的關(guān)系，在肺纖維化進(jìn)程中的作用及調(diào)控的靶基因，探討其在RA-UIP發(fā)病中的作用。1對(duì)象及方法1.1研究對(duì)象及分組選取2019年1—12月就診于包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院的RA患者8例，按是否合并UIP分為RA肺纖維化組（4例），平均（59．25±1．26）歲；RA對(duì)照組（4例），平均（59．75±0．96）歲，2組年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0．298，P＞0．05），男女比例均為1∶3。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）RA診斷滿足2010年美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)和歐洲抗風(fēng)濕病聯(lián)盟提出的RA分類標(biāo)準(zhǔn)。（2）合并UIP的患者滿足2011美國(guó)胸科學(xué)會(huì)和歐洲呼吸學(xué)會(huì)提出的UIP分級(jí)診斷標(biāo)準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）有慢性疾病史。（2）合并其他結(jié)締組織病。（3）非初次治療的RA。（4）合并除肺臟外的其他重要臟器系統(tǒng)損害。（5）行肺組織活檢。本研究通過(guò)包頭醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)審批并獲得研究對(duì)象知情同意。1.2材料RNA提取試劑盒購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司；體外轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自美國(guó)Ambion公司；基因片段和標(biāo)記試劑盒購(gòu)自美國(guó)Affymetrix公司；SYBRGreen熒光定量反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自日本TAKARA公司；人腎上皮細(xì)胞系（293T）購(gòu)自美國(guó)ATCC；人胚肺成纖維細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、細(xì)胞凍存液及胰酶-乙二胺四乙酸（EDTA）購(gòu)自美國(guó)Gibico；Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF）-β1重組蛋白購(gòu)自美國(guó)Selleck公司；CCK-8試劑盒購(gòu)自廣州賽國(guó)生物科技有限公司；小鼠抗人α平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）一抗及羊抗鼠二抗購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司；AffymetrixClariomD基因芯片檢測(cè)和引物設(shè)計(jì)委托南寧友田生物科技有限公司；lnc-NONHSAT074080短發(fā)卡RNA（shRNA）慢病毒載體構(gòu)建由南京臨度醫(yī)療科技有限公司構(gòu)建；Ⅰ型膠原和纖連蛋白酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）試劑盒購(gòu)自廈門侖昌碩生物科技有限公司。Affymetrix雜交爐、GeneChipScanner3000激光掃描儀和AffymetrixFluidicsStation450洗脫站均購(gòu)自美國(guó)Affymetrix公司；qPCR儀7500購(gòu)自美國(guó)ABI公司；二氧化碳培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；低溫冷凍離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)HERMLE公司；酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)MolecularDevices公司；流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司。1.3方法1.3.1AffymetrixClariomD基因芯片檢測(cè)差異基因及生物信息學(xué)分析在確診后未開(kāi)始治療前，收集研究對(duì)象的全血樣本3mL。提取全血總RNA并質(zhì)檢（保證RNA的起始質(zhì)量濃度達(dá)到17mg/L，且RNA無(wú)明顯降解和樣本污染）。取質(zhì)檢合格的250ng總RNA用配套的體外轉(zhuǎn)錄試劑盒制備生物素標(biāo)記的cDNA樣品，將5．5μgcDNA樣品于雜交爐中45℃條件下滾動(dòng)雜交16h，AffymetrixFluidicsStation450將芯片進(jìn)行洗脫、染色后采用GeneChipScanner3000掃描儀進(jìn)行掃描，然后由AffymetrixGeneChipCommandConsole（AGCC）讀取其數(shù)據(jù)，采用GeneSpring軟件（安捷倫科技有限公司）進(jìn)行生物信息學(xué)分析。1.3.2qPCR檢測(cè)上調(diào)lncRNA的表達(dá)選取2組基因芯片比較分析中基因表達(dá)差異倍數(shù)＞2的10個(gè)lncRNA，設(shè)計(jì)特異性引物，引物序列見(jiàn)表1。采用Trizol-RNA提取試劑盒提取患者全血中的總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以此為模板采用SYBRGreen相對(duì)定量法進(jìn)行qPCR驗(yàn)證，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性2min；95℃10s，55℃15s，72℃15s，共40個(gè)循環(huán)。選擇qPCR驗(yàn)證后，RA肺纖維化組lncRNA的表達(dá)高于RA對(duì)照組，且在生物信息學(xué)分析中發(fā)現(xiàn)的與肺纖維化進(jìn)程相關(guān)的lncRNA進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。1.3.3熒光素酶標(biāo)記實(shí)驗(yàn)將lnc-NONHSAT074080結(jié)合序列克隆到表達(dá)載體pcDNA3．1上，構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒；靶基因ARL6IP4的mRNA3'-UTR的片段插入到報(bào)告載體psiCHECK2，構(gòu)建報(bào)告質(zhì)粒。將空載體、lnc-NONHSAT074080表達(dá)質(zhì)粒和ARL6IP4報(bào)告質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人腎上皮細(xì)胞系細(xì)胞，分為空載體對(duì)照組、pCDNA3．1+ARL6IP4-psiCHECK2負(fù)對(duì)照組，pCDNA3．1-NONHSAT074080+psiCHECK2組及pCDNA3．1-NONHSAT074080+ARL6IP4-psiCHECK2組。各組細(xì)胞培養(yǎng)48h后，收集細(xì)胞加入細(xì)胞裂解液，按照熒光素酶檢測(cè)試劑盒的操作說(shuō)明分別加入各檢測(cè)試劑，使用酶標(biāo)儀讀取各組細(xì)胞海腎和螢火蟲熒光強(qiáng)度，以海腎熒光值作為內(nèi)參，計(jì)算各組細(xì)胞熒光素酶活性的比值。Tab.1PrimersequenceoflncRNA表1長(zhǎng)鏈非編碼RNA的引物序列1.3.4人胚肺成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)及處理人胚肺成纖維細(xì)胞系復(fù)蘇培養(yǎng)后以3×106個(gè)/mL的密度接種于培養(yǎng)瓶中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24h后換液，除去未貼壁的細(xì)胞及細(xì)胞碎片，每2～3d換液1次。待細(xì)胞匯合成片后，傳代及鑒定。1.3.5lnc-NONHSAT074080shRNA質(zhì)粒載體的構(gòu)建及細(xì)胞轉(zhuǎn)染針對(duì)NONHSAT074080基因的cDNA序列設(shè)計(jì)shRNA，并構(gòu)建NONHSAT074080shRNA慢病毒載體，轉(zhuǎn)染人胚肺成纖維細(xì)胞，熒光顯微鏡鑒定轉(zhuǎn)染效率，qPCR檢測(cè)NONHSAT074080的基因表達(dá)。lnc-NONHSAT074080shRNA轉(zhuǎn)染效率和沉默效果驗(yàn)證后，將人胚肺成纖維細(xì)胞分為空白對(duì)照組（未處理）、TGF-β1組（細(xì)胞饑餓24h，給予5μg/LTGF-β1）、TGF-β1+NONHSAT074080shRNA組（5μg/LTGF-β1處理后給予lnc-NONHSAT074080shRNA轉(zhuǎn)染48h），收集細(xì)胞及上清液。1.3.6CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力將人胚肺成纖維細(xì)胞以3×103個(gè)/孔的密度接種在96孔板中，每孔100μL，每組3個(gè)復(fù)孔，置于常規(guī)培養(yǎng)箱孵育，細(xì)胞融合度達(dá)80%時(shí)，根據(jù)1.3.5分組進(jìn)行干預(yù)，在干預(yù)0、24、48、72及96h后，每孔加入10μLCCK-8試劑后繼續(xù)孵育細(xì)胞2h，在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定其光密度值，檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)人胚肺成纖維細(xì)胞增殖水平。1.3.7細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)α-SMA的表達(dá)將人胚肺成纖維細(xì)胞以1×104個(gè)/孔密度轉(zhuǎn)移至6孔板制成細(xì)胞爬片，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)到約50%時(shí)，除去培養(yǎng)基，磷酸鹽緩沖液清洗后加入1mL預(yù)冷的95%乙醇置于-20℃固定；吸除乙醇，每孔加入1mL5%胎牛血清蛋室溫封閉20min；加α-SMA一抗室溫孵育60min；PBS清洗后加入含標(biāo)記的羊抗小鼠二抗，5%BSA-PBS室溫避光孵育2h；PBS清洗3次；避光環(huán)境下加入適量6-聯(lián)脒-2'-苯基吲哚（DAPI）染色1min；甘油封片，共聚焦熒光顯微鏡下觀察α-SMA的表達(dá)。1.3.8qPCR檢測(cè)lnc-NONHSAT074080及ARL6IP4的mRNA表達(dá)根據(jù)1.3.5分組對(duì)人胚肺成纖維細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，收集細(xì)胞，Trizol-RNA提取試劑盒提取細(xì)胞的總RNA，參照1.3.2中的qPCR檢測(cè)方法檢測(cè)lnc-NONHSAT074080及ARL6IP4的mRNA表達(dá)水平。lnc-NONHSAT074080及ARL6IP4的引物序列見(jiàn)表1。1.3.9ELISA測(cè)定Ⅰ型膠原及纖連蛋白的表達(dá)將各組人胚肺成纖維細(xì)胞以1×104個(gè)/孔的密度接種于6孔板中，細(xì)胞貼壁后，繼續(xù)培養(yǎng)24h，1000r/min離心10min，取各組細(xì)胞上清液。在Ⅰ型膠原及纖連蛋白抗體預(yù)包被的酶標(biāo)板反應(yīng)孔中依次加入標(biāo)準(zhǔn)品、對(duì)照品和樣品（50μL/孔），室溫孵育2h；加100μL酶結(jié)合物工作液，室溫避光孵育20min；加入50μL終止液終止反應(yīng)。使用酶標(biāo)儀在450nm測(cè)定光密度值，計(jì)算Ⅰ型膠原及纖連蛋白的蛋白表達(dá)水平。每組重復(fù)3次。1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS17．0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，2組間的比較采用t檢驗(yàn)；多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較時(shí)若方差齊采用LSD-t法，方差不齊采用Tamhane法；不同時(shí)間點(diǎn)的多組比較采用重復(fù)測(cè)量的方差分析。P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1RA-UIP疾病相關(guān)lncRNA的篩選和生物信息學(xué)分析基因芯片檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與RA對(duì)照組相比，RA肺纖維化組患者存在192個(gè)上調(diào)表達(dá)的lncRNA（差異倍數(shù)＞1．1，P＜0．05），見(jiàn)圖1。Fig．1UpregulatedlncRNAinwholebloodinthetwogroups圖12組患者全血中表達(dá)上調(diào)的lncRNA2.2qPCR驗(yàn)證差異lncRNA與RA對(duì)照組相比，RA肺纖維化組lncRNANONHSAT074080、NONHSAT071210、NONHSAT047350、NONHSAT101272、DPYD-IT1及NONHSAT082317的mRNA表達(dá)明顯升高（P＜0．05），而RP11-158I9．5．1-2：1、RP11-326I11．5、TMEM140-1：1及NONHSAT115197在2組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表2。2.3lnc-NONHSAT074080的生物信息學(xué)分析對(duì)上述結(jié)果中qPCR驗(yàn)證的6個(gè)在RA肺纖維化組高表達(dá)的lncRNA進(jìn)行生物信息學(xué)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與纖維化生物學(xué)功能相關(guān)的為lnc-NONHSAT074080，見(jiàn)圖2；lnc-NONHSAT074080可能作用的靶基因包括ARL6IP4，且為上調(diào)靶基因，見(jiàn)圖3；lnc-NONHSAT074080可能通過(guò)分裂原激活蛋白激酶（MAPK）、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和激活因子（STAT）等信號(hào)通路發(fā)揮作用，見(jiàn)圖4。Fig．2Bioinformaticsanalysisshowingbiologicalfunctionoflnc-NONHSAT074080圖2生物信息學(xué)分析lnc-NONHSAT074080的生物學(xué)功能2.4lnc-NONHSAT074080對(duì)靶基因ARL6IP4的調(diào)控作用熒光素酶基因報(bào)告顯示，空載體對(duì)照組、pCDNA3．1+ARL6IP4-psiCHECK2負(fù)對(duì)照組、pCDNA3．1-NONHSAT074080+psiCHECK2組和pCDNA3．1-NONHSAT074080+ARL6IP4-psiCHECK2組ARL6IP4的熒光表達(dá)量分別為1．491±0．066、0．931±0．027、1．493±0．009和1．149±0．039，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（n=3，F(xiàn)=172．570，P＜0．05）。與空載體對(duì)照組相比，pCDNA3．1+ARL6IP4-psiCHECK2負(fù)對(duì)照組ARL6IP4的熒光表達(dá)量明顯降低（P＜0．05）；pCDNA3．1-NONHSAT074080+psiCHECK2組ARL6IP4的熒光表達(dá)量較pCDNA3．1+ARL6IP4-psiCHECK2負(fù)對(duì)照組升高（P＜0．05）。Tab.2ComparisonofupregelatedlncRNAexpressionsinwholebloodbetweenthetwogroupsofpatients表22組患者全血中上調(diào)表達(dá)的lncRNA表達(dá)水平比較（n=4，±s）Tab.2ComparisonofupregelatedlncRNAexpressionsinwholebloodbetweenthetwogroupsofpatients表22組患者全血中上調(diào)表達(dá)的lncRNA表達(dá)水平比較（n=4，±s）＊P＜0．05，＊＊P＜0．01。組別RA對(duì)照組RA肺纖維化組tNONHSAT0740801．000±0．0026．108±2．1802．343＊NONHSAT0712101．000±0．3172．447±0．2126．097＊＊RP11-158I9．5．1-2:11．000±0．0540．637±0．1622．239NONHSAT0473501．000±0．2533．868±0．7283．911＊＊NONHSAT1012721．000±0．0022．885±0．5173．646＊＊組別RA對(duì)照組RA肺纖維化組tRP11-326I11．51．000±0．0033．396±1．4871．611DPYD-IT11．000±0．0062．418±0．4473．172＊TMEM140-1：11．000±0．0653．453±1．3001．886NONHSAT1151971．000±0．0121．341±0．2071．649NONHSAT0823171．000±0．0042．099±0．2374．643＊＊2.5lnc-NONHSAT074080對(duì)人胚肺成纖維細(xì)胞增殖的影響與空白對(duì)照組相比，TGF-β1組細(xì)胞增殖水平在干預(yù)24、48、72和96h后升高（P＜0．05）；與TGF-β1組相比，TGF-β1+NONHSAT074080shRNA組細(xì)胞增殖能力在干預(yù)48、72及96h后明顯下降（P＜0．05），見(jiàn)表3。2.6lnc-NONHSAT074080對(duì)α-SMA表達(dá)的影響免疫熒光結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，TGFβ1組α-SMA的熒光表達(dá)升高；但TGF-β1+NONHSAT074080shRNA組與TGF-β1組相比，α-SMA的熒光表達(dá)明顯減少，見(jiàn)圖5。2.7lnc-NONHSAT074080及ARL6IP4與纖維化的關(guān)系與空白對(duì)照組相比，TGF-β1組的人胚肺成纖維細(xì)胞中l(wèi)nc-NONHSAT074080及ARL6IP4mRNA表達(dá)水平明顯升高（P＜0．05）；TGF-β1+NONHSAT074080shRNA組lnc-NONHSAT074080和ARL6IP4mRNA表達(dá)水平較TGF-β1組明顯降低（P＜0．05），見(jiàn)表4。2.8lnc-NONHSAT074080對(duì)纖維化進(jìn)程相關(guān)因子表達(dá)的影響ELISA結(jié)果顯示，TGF-β1組Ⅰ型膠原Fig．3bioinformaticsanalysisshowingpossibletargetgeneoflnc-NONHSAT074080圖3生物信息學(xué)分析lnc-NONHSAT074080可能調(diào)控的靶基因Fig．4Boinformaticsanalysisshowingsignalpathwaysoflnc-NONHSAT074080圖4生物信息學(xué)分析lnc-NONHSAT074080作用相關(guān)的信號(hào)通路Tab.3Theproliferationofdifferentinterventionsinhumanembryoniclungfibroblastsatdifferenttimepoints表3不同處理組人胚肺成纖維細(xì)胞各時(shí)間點(diǎn)的增殖水平（n=3，±s）Tab.3Theproliferationofdifferentinterventionsinhumanembryoniclungfibroblastsatdifferenttimepoints表3不同處理組人胚肺成纖維細(xì)胞各時(shí)間點(diǎn)的增殖水平（n=3，±s）＊P＜0．05，＊＊P＜0．01；a與空白對(duì)照組比較，b與TGF-β1組比較，P＜0．05；F時(shí)間=915．877＊，F(xiàn)組間=60．625＊，F(xiàn)交互=27．388＊。組別空白對(duì)照組TGF-β1組TGF-β1+NONHSAT074080shRNA組F0h0．063±0．0090．061±0．0060．059±0．0050．52424h0．496±0．0340．689±0．010a0．804±0．01851．234＊＊48h0．844±0．0400．975±0．012a0．739±0．113b63．895＊＊72h1．088±0．0191．336±0．016a1．065±0．025b39．174＊＊96h1．183±0．0911．528±0．055a1．098±0．025b28．110＊＊Fig．5Theexpressionofα-SMAinhumanembryoniclungfibroblaststreatedwithdifferentinterventions(×400,rhodaminedying）圖5不同處理組人胚肺成纖維細(xì)胞中α-SMA的表達(dá)（×400，四乙基羅丹明染色）和纖連蛋白的表達(dá)高于空白對(duì)照組（P＜0．05）；與TGF-β1組比較，TGF-β1+NONHSAT074080shRNA組Ⅰ型膠原和纖連蛋白明顯降低（P＜0．05），見(jiàn)表5。Tab.4Comparisonoflnc-NONHSAT074080andARL6IP4geneexpressionbetweenthethreegroups表4各組lnc-NONHSAT074080及ARL6IP4基因表達(dá)水平（n=3，±s）Tab.4Comparisonoflnc-NONHSAT074080andARL6IP4geneexpressionbetweenthethreegroups表4各組lnc-NONHSAT074080及ARL6IP4基因表達(dá)水平（n=3，±s）＊P＜0．05，＊＊P＜0．01；a與空白對(duì)照組比較，b與TGF-β1組比較，P＜0．05。組別空白對(duì)照組TGF-β1組TGF-β1+NONHSAT074080shRNA組Flnc-NONHSAT0740801．000±0．0723．617±0．150a1．676±0．177abARL6IP41．000±0．0391．862±0．080a1．072±0．131b72．644＊＊32．106＊Tab.5ComparisonoftheexpressionlevelsoftypeIcollagenandfibronectinbetweenthethreegroups表5各組I型膠原和纖連蛋白表達(dá)水平比較（n=3，μg/L，±s）Tab.5ComparisonoftheexpressionlevelsoftypeIcollagenandfibronectinbetweenthethreegroups表5各組I型膠原和纖連蛋白表達(dá)水平比較（n=3，μg/L，±s）＊＊P＜0．01；a與空白對(duì)照組比較，b與TGF-β1組比較，P＜0．05。組別空白對(duì)照組TGF-β1組TGF-β1+NONHSAT074080shRNA組FI型膠原2．490±0．0987．008±0．344a3．160±0．081ab132．528＊＊纖連蛋白22．906±1．68840．517±1．978a23．058±1．505b34．056＊＊3討論肺纖維化是RA-UIP的主要特征，剖析纖維化發(fā)生發(fā)展相關(guān)的致病因素是深入研究RA-UIP發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵。近年來(lái)，隨著非編碼RNA在肺纖維化發(fā)病中的研究不斷深入，lncRNA在纖維化進(jìn)程中的作用也開(kāi)始受到關(guān)注［6］。研究發(fā)現(xiàn)，lncRNAZFAS1在博來(lái)霉素誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠肺組織及TGF-β1誘導(dǎo)的人胚肺成纖維細(xì)胞中高表達(dá)，且通過(guò)調(diào)控miR-150-5p/SLC38A1軸發(fā)揮作用［7］。lncRNAAK088388和AK081523在博來(lái)霉素誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠體內(nèi)高表達(dá)，并作用于miR-29b-3p和let-7i-5p，調(diào)控N4bp2和plxna4基因的表達(dá)參與肺纖維化的發(fā)病［8］；lncRNACHRF作用于miR-489促進(jìn)二氧化硅誘導(dǎo)的肺纖維化，miR-489在肺纖維化小鼠巨噬細(xì)胞和TGF-β1處理的成纖維細(xì)胞中的表達(dá)減低，通過(guò)調(diào)控靶基因MyD88及Smad3參與肺纖維化的發(fā)?。?］；lncRNAuc．77及l(fā)ncRNA2700086A05Rik調(diào)節(jié)肺泡上皮的間質(zhì)轉(zhuǎn)化，在肺纖維化的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用［10］。本研究收集RA-UIP和RA無(wú)ILD的患者全血，以Affymetrix基因芯片技術(shù)篩選差異表達(dá)的lncRNA，發(fā)現(xiàn)RA-UIP患者全血中存在192個(gè)上調(diào)表達(dá)的lncRNA，選擇上調(diào)表達(dá)較明顯的lncRNAs進(jìn)行PCR驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)與RA無(wú)ILD的患者相比，lnc-NONHSAT074080在RA肺纖維化組患者全血中的表達(dá)明顯升高，且生物信息學(xué)關(guān)于功能分析提示qPCR驗(yàn)證的6個(gè)高表達(dá)的lncRNAs中，lnc-NONHSAT074080與纖維化進(jìn)程相關(guān)。同時(shí)，體外實(shí)驗(yàn)采用TGF-β1誘導(dǎo)肺成纖維細(xì)胞的纖維化進(jìn)程，發(fā)現(xiàn)人胚肺成纖維細(xì)胞經(jīng)TGF-β1誘導(dǎo)后，lnc-NONHSAT074080表達(dá)較空白對(duì)照組明顯升高，人胚肺成纖維細(xì)胞的增殖水平、肌成纖維細(xì)胞標(biāo)志物α-SMA水平及纖維化進(jìn)程相關(guān)的Ⅰ型膠原和纖連蛋白的表達(dá)水平也明顯升高。為進(jìn)一步證實(shí)lnc-NONHSAT074080在纖維化進(jìn)程中的作用，筆者構(gòu)建lnc-NONHSAT074080shRNA慢病