考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蘋果組織微量可溶性蛋白含量摘要本實(shí)驗(yàn)以蘋果果肉為研究對(duì)象，采取考馬斯亮藍(lán)比色法測(cè)定蛋白質(zhì)的吸光度值，通過對(duì)果實(shí)可溶性蛋白提取緩沖液、緩沖液濃度、pH值、外源添加物對(duì)果肉可溶性蛋白提取效率的影響的研究，優(yōu)化蘋果果實(shí)可溶性蛋白含量測(cè)定方法，以期優(yōu)化果實(shí)可溶性蛋白測(cè)定條件，為客觀反映果實(shí)可溶性蛋白水平提供一種可行的方法。結(jié)果表明：外源添加PVP和EDTA以是蘋果可溶性蛋白提取率的主要影響因素。實(shí)驗(yàn)最終確定的提取條件為0.1mol/LpH9.0Tris-HCl提取緩沖液(內(nèi)含1mmol/LEDTA和1%PVP)。前言果蔬可溶性蛋白質(zhì)含量(solubleproteincontent)是一個(gè)重要的生理生化指標(biāo)，也是果蔬品質(zhì)和營養(yǎng)的重要評(píng)價(jià)指標(biāo)之一。許多可溶性蛋白是構(gòu)成果蔬中酶的重要組成部分，參與果蔬多種生理生化代謝過程的調(diào)控，與果蔬的生長發(fā)育、成熟衰老，抗病性、抗逆性密切相關(guān)。以比活力(unit/mgprotein)表示酶活力大小及酶制劑純度時(shí)，可溶性蛋白的測(cè)定也是必不可少的。1實(shí)驗(yàn)部分1.1實(shí)驗(yàn)原理比活力(unit/mgprotein)表示酶活力大小及酶制劑純度，同時(shí)采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)相結(jié)合，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線?？捡R斯亮藍(lán)G-250在酸性游離狀態(tài)下呈棕紅色，最大光吸收在465nm，當(dāng)它與蛋白質(zhì)結(jié)合后變?yōu)樗{(lán)色，最大光吸收在595nm。在一定的蛋白質(zhì)濃度范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)-染料復(fù)合物在波長為595nm處的光吸收與蛋白質(zhì)含量成正比，通過測(cè)定595nm處光吸收的增加量可知與其結(jié)合蛋白質(zhì)的量。該方法標(biāo)本用量少、靈敏度高、重復(fù)性好，是一種較為理想的方法[7]。但該方法線性范圍窄，需要選擇適宜的提取緩沖液及緩沖液濃度、pH值、料液比和外源添加物等，以使測(cè)定方法有較高的靈敏度，測(cè)定值與真值相近。1.2實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備1.2.1實(shí)驗(yàn)材料新鮮蘋果、牛血清白蛋白、考馬斯亮藍(lán)G-250、乙醇、85%磷酸、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、HCl、乙二胺四乙酸（EDTA）、聚乙烯比咯烷酮(PVP)、NaCl、MgCl2、抗壞血酸、半胱氨酸、β-巰基乙醇。1.2.2儀器與設(shè)備容量瓶（25mL10個(gè)、100mL1個(gè)、500mL1個(gè)、棕色瓶1個(gè)、分析天平、膠頭滴管、燒杯（50mL2個(gè)）、移液管（20mL）、量筒（10mL1個(gè)、25mL1個(gè)）、研缽；UV-1800型紫外-可見光分光光度計(jì)日本島津公司；旋渦混合器；PH計(jì)。1.2.3試劑配制1.2.3.1標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液(100μg/mL牛血清白蛋白)：稱取牛血清蛋白25mg，加水溶解并定容至100mL，吸取上述溶液40mL，用蒸餾水稀釋至100mL；1.2.3.2考馬斯亮藍(lán)試劑：稱取50mg考馬斯亮藍(lán)G-250，溶于25mL90%乙醇中，加入50mL85g/100mL的磷酸，再用蒸餾水定容到500mL，搖勻，貯于棕色瓶中；1.2.3.3提取液：pH7.2、7.4、7.6、7.8、8.0、8.2、8.4、8.6、8.8和9.0梯度Tris-HCl緩沖液(100mmol/L)；1.2.3.4梯度濃度Tris-HCl緩沖液(pH9.0)：10、30、50、80、100mmol/L；1.2.3.5外源添加添加量：乙二胺四乙酸(EDTA)(1mmol/L)、聚乙烯比咯烷酮(PVP)(1g/100mL)、NaCl(0.15mol/L)、MgCl2(0.5mmol/L)、抗壞血酸(2mmol/L)、半胱氨酸(2mmol/L)、β-巰基乙醇(2%，V/V)。1.3實(shí)驗(yàn)步驟1.3.1考馬斯亮藍(lán)G-250溶液及其蛋白反應(yīng)液全波長掃描取3mL配制好的考馬斯亮藍(lán)G-250溶液或其與蛋白反應(yīng)液，置于1cm光程玻璃比色皿中，以紫外分光光度計(jì)在400～800nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，確定考馬斯亮藍(lán)G-250溶液和其蛋白反應(yīng)液的最大吸收峰和空白吸收值。1.3.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制取6支試管，按表1加入標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液和蒸餾水，混勻后，向各管中加入5mL考馬斯亮藍(lán)G-250溶液。每加完一支試管，立即在旋渦混合器上混合(注意不要太劇烈，以免產(chǎn)生大量氣泡而難于消除)?；旌虾箪o置5min左右，以0號(hào)試管為空白對(duì)照，在595nm波長處測(cè)定吸光度。以蛋白質(zhì)含量為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得線性回歸方程表1繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的各試劑添加量項(xiàng)目管號(hào)012345100μg/mL牛血清白蛋白溶液/mL00.20.40.60.81.0蒸餾水/mL1.00.80.60.40.201.3.3果蔬組織可溶性蛋白質(zhì)的提取1.3.3.1最佳緩沖溶液和pH值的確定稱取蘋果果肉樣品1g，加入5mL水或梯度pH值Tris-HCl緩沖液，冰浴上充分研磨勻漿，移入10mL離心管中，于4000rpm離心15min，收集上清液即為可溶性蛋白質(zhì)提取液，低溫保存?zhèn)溆肹8]。1.3.3.2最佳提取緩沖液濃度的確定以3.3.1節(jié)確定的提取緩沖鹽和pH值為基準(zhǔn)，分別配制該pH值下濃度依次為0、10、30、50、80、100mmol/L的提取緩沖液[9]。提取體系及方法同3.1節(jié)。1.3.3.3適宜外源添加物的確定以3.3.2節(jié)確定的最佳緩沖溶液為基準(zhǔn)，分別添加以下濃度的添加物：EDTA(1mmol/L)、PVP(1g/100mL)、NaCl(0.15mol/L)、MgCl2(0.5mmol/L)、抗壞血酸(2mmol/L)、半胱氨酸(2mmol/L)和β-巰基乙醇(2%，V/V)。提取體系及方法同3.1節(jié)[7-13]。（添加組合為：抗壞血酸、半胱氨酸、EDTA、PVP、β-巰基乙醇、NaCl、MgCl2、PVP＋β-巰基乙醇、PVP＋EDTA、EDTA＋PVP＋β-巰基乙醇）1.3.3.4蘋果組織可溶性蛋白質(zhì)含量的測(cè)定吸取1.0mL樣品上清液，放入試管中，加入5.0mL考馬斯亮藍(lán)G-250溶液，充分混合，放