辨體調理膏制劑工藝的優(yōu)化

冬季用藥已成為人們恢復和調節(jié)身體、糾正健康狀況的最受歡迎的方法之一。辨體調理膏是我院使用人數(shù)最多的膏方,是由多位名老中醫(yī)研究得出的用于冬令滋補調理的代表方劑。全方由銀杏200g,山藥120g,薏苡仁200g,山楂250g,陳皮120g,紅棗120g,核桃200g,芝麻200g,龜甲膠250g,阿膠250g,冰糖250g組成,藥味少而經典,主治勞倦內傷、氣弱血虛、陽浮外越,并且它也是組成各類膏方的基礎方藥,臨床應用十分廣泛。目前,辨體調理膏是按傳統(tǒng)經驗制備,各批次膏方會有一定的質量差異,也可能導致臨床療效的不同,因此,對其制劑工藝的研究十分必要。國內外文獻報道膏方的制劑研究很少,還沒有形成一套嚴謹規(guī)范的工藝流程,本研究將對膏方制備過程中的幾個重要環(huán)節(jié),包括藥材煎煮條件、煎煮容器、膠類藥烊化等進行研究,以確定辨體調理膏的最佳工藝條件,從而保證有效成分含量的穩(wěn)定性和膏方質量的可靠性,達到安全、有效用藥的目的。1儀器、試劑和儀器Agilent1100高效液相色譜系統(tǒng)(AgilentTechnologies,USA),配四元梯度泵、在線脫氣機、紫外檢測器、ChemStation工作站控制系統(tǒng);TU-1901雙光束紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限公司,中國);METTLERAE240電子天平(梅特勒-托利多上海有限公司,中國);MinispanPlus臺式高速離心機(杭州奧盛儀器有限公司,中國);MILI-Q超純水系統(tǒng)(Millipore,USA);KQ-250E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司,中國)等。標準品橙皮苷(純度≥99.0%)購于中國藥品生物制品檢定所;明膠(BC)、硫酸銅(AR)、四水合酒石酸鉀鈉(AR)均購自上海晶純試劑有限公司;氫氧化鈉(AR)購于杭州蕭山化學試劑廠;乙腈(特級色譜純)和甲醇(一級色譜純)購于天津市四友生物醫(yī)學技術有限公司;甲酸(AR)購自上海國藥集團化學試劑有限公司;辨體調理膏及其原料藥材由本院中藥房提供。2方法和結果2.1a/vv/v乙腈+乙腈b相AglientZORBAXSB-C18色譜柱(4.6mm×250mm,5.0μm);流動相:水相D相為0.05%甲酸-水(V/V),有機相B相為乙腈,梯度洗脫,0～7min,8%～15%B,7～16min,15%～20%B,16～20min,20%～24%B,20～24min,24%～24%B,24～30min,24%～85%B,30～35min,85%～95%B,流速為0.8mL/min;進樣量為20μL;柱溫為25℃;檢測波長為280nm。2.2水合酒石酸鉀鈉knac4h4h3.4h2o的制備稱取硫酸銅(CuSO4·5H2O)0.75g、四水合酒石酸鉀鈉(KNaC4H4O6·4H2O)3.0g溶于250mL水中,在攪拌條件在下加入10%NaOH溶液150mL,用水稀釋至500mL,即得。2.3對照品溶液配制精密稱取橙皮苷標準品4.60mg,用甲醇溶解,并定容于10mL容量瓶中,配制成濃度為0.46mg/mL儲備液,于4℃避光保存。分別精密吸取儲備液適量,并稀釋成系列濃度的對照品溶液,供分析用。精密稱取明膠1.07g,用純水溶解,超聲15min,并定容于50mL量瓶中,配制成21.40mg/mL儲備液,于4℃避光保存。供分析用。2.4制備最佳規(guī)劃劑稱取辨體調理膏組方藥材銀杏40g,山藥24g,米仁40g,山楂50g,陳皮24g,紅棗24g,用水浸泡20min,采用3因素3水平L9(34)正交實驗法,因素和水平設計見表1,考察膏方藥材的煎煮條件。在同一煎煮條件下,采用砂鍋、陶瓷鍋、不銹鋼鍋、考察膏方藥材的煎煮容器。每組樣品濃縮至800mL,真空包裝成4小包,4℃冰箱中保存,供分析用。精密吸取上述過程制備的樣品各2.5mL,用水稀釋,搖勻,并定容至5.0mL,用0.45μm濾膜過濾,濾液作為供試品溶液。精密稱取阿膠5.0g,分別采用水加熱烊膠、黃酒加熱烊膠、水溶微波烊膠3種方法進行烊膠,水和黃酒各加10.0mL,得到烊膠后的樣品溶液。精密吸取樣品溶液0.2mL,稀釋50倍,取1.0mL,加雙縮尿試劑4.0mL,混勻,常溫下顯色30min,554nm處檢測,考察不同烊膠方法所致的阿膠蛋白質含量差異。精密稱取龜甲膠8.0g,水和黃酒各加16.0mL,龜甲膠烊膠方式考察方法同阿膠。2.5方法的精密度、準確度和回收率采用優(yōu)化后的液相色譜條件,進樣分析一系列濃度(4.60×10-3～4.60×102μg/mL)的橙皮苷標準品溶液,以峰面積為縱坐標,濃度為橫坐標,繪制標準曲線,得到線性回歸方程y=38729x+59.711,相關系數(shù)R2=0.9995,線性良好。測定信噪比為3時的進樣濃度即檢測限(LOD),LOD為1.42×10-3μg/mL,測定信噪比為10時的進樣濃度即定量限(LOQ),LOQ為4.60×10-3μg/mL,方法靈敏度高。配制濃度為72.00μg/mL橙皮苷標準品溶液6份,同一天內進樣分析,計算日內精密度,RSD為2.41%,連續(xù)6日每日進樣分析,計算日間精密度,RSD為4.06%,精密度良好。按供試品溶液制備方法,制備6份供試品溶液進樣分析,以橙皮苷的濃度計算其RSD,來評估方法的重復性,RSD為3.60%;按供試品溶液制備方法,分別于0、2、6、12、24h進樣分析,以橙皮苷濃度計算其RSD,結果為1.41%;按加樣回收率測定方法,分別在已知含量的樣品中,加入中濃度的橙皮苷標準品溶液,按照供試品溶液制備方法制備供試品6份,進樣分析,計算加樣回收率,RSD為3.72%,回收率為95.85%;以上結果證明該分析方法重現(xiàn)性、穩(wěn)定性和準確度好。本法可適用于辨體調理膏制劑過程分析。2.6外標法進行的檢測膏方藥材煎煮條件的篩選采用3因素3水平正交實驗法進行,9組實驗液相分析結果見圖1所示,并采用外標法測定了主要有效成分橙皮苷的含量,以橙皮苷含量為指標,進行方差分析,結果見表2。2.7液相分析結果選取目前常用的煎膏容器砂鍋、陶瓷鍋、不銹鋼鍋,在同一煎煮條件下進行實驗,液相分析結果見圖2所示,外標法測定3組樣品中橙皮苷的含量,結果為C砂鍋=175.48μg/mL,C陶瓷鍋=115.69μg/mL,C不銹鋼鍋=41.47μg/mL。2.8種中小型膠的蛋白質含量采用水加熱烊膠、黃酒加熱烊膠、水溶微波烊膠3種方法分別烊化阿膠和龜甲膠,以明膠為對照品,紫外分光光譜法檢測蛋白質含量,考察這3種烊膠方法對阿膠和龜甲膠中蛋白質含量的影響,結果見圖3所示。3討論3.1流動相梯度優(yōu)化色譜條件優(yōu)化過程中,對流動相溶劑(甲醇、乙腈)、流動相梯度、流動相酸度(0.01%、0.025%、0.05%、0.075%甲酸)、流速(0.8、1.0、1.2mL/min)進行了考察。結果發(fā)現(xiàn),乙腈對化合物的洗脫能力強于甲醇,使得分析時間明顯縮短,而且對橙皮苷的分離效果也比較好;在流動相梯度優(yōu)化過程中采用了梯度洗脫的模式,并且在橙皮苷出峰前的一小段時間內采用有機相(B)比例為24%,水相(D)比例為76%的等度洗脫,使得橙皮苷色譜峰與其相鄰色譜峰(柚皮苷)達到基線分離(見圖4),充分保證了橙皮苷含量測定的準確性;隨著流動相酸度增大,橙皮苷色譜峰的峰形得到改善,但是考慮到過高的酸度可能對色譜柱的使用壽命產生影響,所以選擇甲酸的濃度為0.05%。3.2不同制備工藝對藥材質量的影響從圖1中可以看出,隨著藥材煎煮次數(shù)的增多,藥材有效成分的煎出率顯著提高,煎煮3次可使各種藥材的有效成分充分提取出來,但是發(fā)現(xiàn)并不是煎煮時間越長,有效成分含量越高,因為有些成分可能隨著煎煮時間的延長而分解,橙皮苷就是這類成分,表1中橙皮苷含量測定結果也證實了這一現(xiàn)象,以橙皮苷含量為指標的方差分析結果表明,煎煮時間對橙皮苷含量有顯著性影響,而加水量和煎煮次數(shù)無顯著性影響,此外,從圖1中并不能發(fā)現(xiàn)加水量對藥材煎出率的明顯改變?？紤]到煎煮次數(shù)的增加可使各類藥材的有效成分充分提取出來,并結合生產實際,最終將藥材煎煮條件確定為:煎煮時間30min,加水量8倍,煎煮次數(shù)3次。在該條件下進行辨體調理膏制劑的生產,既保證了膏方藥材有效成分的煎出率,又能減少損失提高效率。3.3外標法測定橙皮苷的含量從圖2中發(fā)現(xiàn),使用砂鍋煎煮膏方,可使膏方藥材有效成分的煎出率顯著提高,且明顯高于陶瓷鍋和不銹鋼鍋,外標法測定橙皮苷的含量結果顯示,使用砂鍋作為煎膏容器所得的橙皮苷含量是使用不銹鋼鍋為煎膏容器所得的橙皮苷含量的4倍,陶瓷鍋也比不銹鋼鍋高出2倍,因此民間常用砂鍋或陶瓷鍋煎煮膏方,但現(xiàn)在也有不少病人出于便利采用不銹鋼鍋煎煮膏方,勢必影響藥材有效成分的含量,不能達到最佳的治療目的,故建議病人采用砂鍋煎煮膏方藥材。3.4微波加熱實驗圖3顯示了不同烊膠方法對阿膠和龜甲膠中蛋白質含量的影響,黃酒加熱烊膠所得到的蛋白質最多,水加熱烊膠次之,而水溶微波烊膠得到的蛋白質最少,且明顯少于前兩者,可能是由于微波引起部分蛋白質的降解。雖然有不少病人出于便捷而使用微波爐來烊化阿膠等膠類藥