三七總皂甙對(duì)胎鼠皮層神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化、自我更新及bdnf、bfgf表達(dá)的影響

老鼠腦的許多腦區(qū)域都有神經(jīng)干（nsc），它們被激活并最終分為神經(jīng)和皮質(zhì)細(xì)胞。成年腦內(nèi)仍保留的神經(jīng)干細(xì)胞則主要位于側(cè)腦室室管膜下層(SVZ,subependymalventricalzone)和海馬齒狀回顆粒細(xì)胞下層(subgranularzone,SGZ),它們相對(duì)靜止或增殖緩慢。以往實(shí)驗(yàn)從胎鼠紋狀體、海馬、皮層成功分離了神經(jīng)干細(xì)胞,它們?cè)跔I(yíng)養(yǎng)因子bFGF或EGF作用下增殖并分化成神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞,因此可用胎鼠神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)行離體實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)擬選取17d胎鼠皮層神經(jīng)干細(xì)胞,通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)及免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)測(cè)定它們的增殖和分化以及三七總皂甙對(duì)其的影響,進(jìn)一步闡明三七總皂甙的作用機(jī)理。免疫細(xì)胞化學(xué)選取抗體Nestin標(biāo)記神經(jīng)干細(xì)胞或神經(jīng)前體細(xì)胞、PCNA檢測(cè)神經(jīng)干細(xì)胞或神經(jīng)前體的增殖、Tuj-1和NF檢測(cè)未成熟和成熟神經(jīng)元、Vimentin和GFAP檢測(cè)未成熟和成熟膠質(zhì)細(xì)胞,同時(shí)檢測(cè)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子bFGF和BDNF的表達(dá)。1材料和方法1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物已妊娠17d的Wistar雌性大鼠,由協(xié)和醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物所提供。1.2細(xì)胞培養(yǎng)試劑DMEM/F12(Gibco)、B27(Gibco)、胎牛血清(Sigma)。1.3無(wú)血清基礎(chǔ)培養(yǎng)液組dmem/fps在超凈工作臺(tái)上,嚴(yán)格無(wú)菌操作下取E17的Wistar大鼠皮層組織,剝離腦膜,解剖液清洗血污后,在DMEM/F12(體積比1∶1)剪成1mm3碎塊,加入0.125%胰蛋白酶溶液,37℃消化25min,其間輕搖2次,加入10%胎牛血清終止消化,用DMEM/F12洗去血清,吸管機(jī)械性反復(fù)吹打后制成單細(xì)胞懸液,經(jīng)胎盤(pán)藍(lán)計(jì)數(shù)活性細(xì)胞。用含B27和DMEM/F12的無(wú)血清基礎(chǔ)培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞含量為2×105mL-1,將細(xì)胞懸液分裝于涂有多聚賴氨酸的25ml細(xì)胞培養(yǎng)瓶(每瓶5ml)和加蓋玻片的12孔培養(yǎng)板(每孔1ml),分為對(duì)照組和給藥組,其中對(duì)照組為含B27和DMEM/F12的無(wú)血清基礎(chǔ)培養(yǎng)液,給藥組在對(duì)照組培養(yǎng)條件基礎(chǔ)上加入三七總皂甙(100ug/mL)。對(duì)照組和給藥組置于37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。1.4p2p細(xì)胞傳代增殖觀察為研究三七總皂甙對(duì)NSCs增殖和自我更新的作用,將原代培養(yǎng)7d的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞傳代和單細(xì)胞克隆。原代細(xì)胞經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)7d后傳代,細(xì)胞含量2×104mL-1,稱為P1細(xì)胞,P1細(xì)胞培養(yǎng)7d后再傳代,細(xì)胞含量2×104mL-1,稱為P2細(xì)胞。原代細(xì)胞進(jìn)行傳代的同時(shí),另進(jìn)行細(xì)胞單細(xì)胞克隆,即將原代細(xì)胞懸液經(jīng)培養(yǎng)液稀釋,進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)至稀釋到每mL含活細(xì)胞數(shù)為1-2個(gè)后,將細(xì)胞懸液加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板,每孔100μL,記錄只含1個(gè)細(xì)胞的孔進(jìn)行觀察。以上P1細(xì)胞、P2細(xì)胞及單細(xì)胞克隆的分組和培養(yǎng)液條件同原代細(xì)胞,不同的是培養(yǎng)瓶和培養(yǎng)板不涂多聚賴氨酸,而使其懸浮生長(zhǎng)。1.5u3000spb的制作將培養(yǎng)板培養(yǎng)的對(duì)照組、給藥組原代細(xì)胞于培養(yǎng)第4d,分別進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)反應(yīng),以觀察兩組原代細(xì)胞培養(yǎng)4d時(shí)Nestin的表達(dá)、增殖以及分化為神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的情況,并觀察營(yíng)養(yǎng)因子bFGF、BDNF的表達(dá)。具體方法采用ABC法:(1)用吸管吸出培養(yǎng)板孔中的培養(yǎng)液,0.01MPBS(PH=7.2)沖洗3遍;(2)4%多聚甲醛/0.1MPB(pH7.2-7.4)固定20min,0.01MPBS沖洗3遍,每次5min;(3)1%H2O2(甲醇配置),室溫15min,0.01MPBS沖洗3遍,每次5min;(4)10%正常羊血清封閉,室溫20min;(4)一抗孵育,4℃過(guò)夜;(5))S-A/HRP工作液(ZYMED)37℃2小時(shí),0.01MPBS洗3次,每次5分鐘;(6)0.05%DAB-0.01%H2O2液顯色,脫水封片。陰性對(duì)照片省去一抗,用0.01MPBS代替。一抗分別為小鼠抗Nestin(1:500,Pharmingen)、小鼠抗PCNA(1:80,ZYMED)、兔抗Tuj-1(1:1000,R&D)、小鼠抗NF(1:80,SantaCruz)、小鼠抗Vimentin(工作液,Sigma)、兔抗GFAP(1:500,ZYMED)、兔抗bFGF(1:800,SantaCruz)、兔抗BDNF(1:80,SantaCruz)一抗稀釋用0.01MPBS;1.6免疫陽(yáng)性細(xì)胞檢測(cè)采用CMIAS真彩圖像分析系統(tǒng)(北京航空航天大學(xué)生產(chǎn))對(duì)Nestin、PCNA、Tuj-1、NF、VimentinGFAP免疫陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行測(cè)量分析,每組隨機(jī)取3張切片,每張切片隨機(jī)取3個(gè)視野,記錄每個(gè)統(tǒng)計(jì)場(chǎng)的陽(yáng)性個(gè)數(shù),用平均陽(yáng)性細(xì)胞個(gè)數(shù)(xˉ±s)(xˉ±s)表示各組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量水平,組間比較采用t檢驗(yàn)。2結(jié)果2.1細(xì)胞球的組成相差顯微鏡下觀察到對(duì)照組和給藥組原代培養(yǎng)的細(xì)胞接種2h后貼壁生長(zhǎng),細(xì)胞體較小,部分細(xì)胞出現(xiàn)2-3個(gè)核仁,和1-2個(gè)短而細(xì)的突起,原代培養(yǎng)3-4d后,細(xì)胞胞體增大,突起增多,給藥組細(xì)胞的數(shù)量明顯多于對(duì)照組,并且在給藥組可見(jiàn)到多個(gè)懸浮生長(zhǎng)的由數(shù)十至數(shù)百個(gè)細(xì)胞組成的大小不等的細(xì)胞球,細(xì)胞球中央的細(xì)胞無(wú)突起,胞體明亮,體積較小,胞體內(nèi)可見(jiàn)到1-2個(gè)核仁,細(xì)胞球周邊細(xì)胞帶有1-2個(gè)突起(圖1)。給藥組的P1、P2細(xì)胞培養(yǎng)3-4d后中也有明顯的由數(shù)十至數(shù)百個(gè)細(xì)胞組成細(xì)胞球存在。對(duì)照組原代細(xì)胞和P1、P2細(xì)胞中細(xì)胞球的數(shù)量明顯少于給藥組,并且細(xì)胞球體積較小。觀察96孔板中每孔只有一個(gè)細(xì)胞的P1細(xì)胞單細(xì)胞克隆發(fā)現(xiàn),在給藥組極少數(shù)(2-3個(gè))單個(gè)細(xì)胞在培養(yǎng)3-4d后,由一個(gè)細(xì)胞形成由數(shù)十至數(shù)百個(gè)細(xì)胞組成細(xì)胞球,不同單個(gè)細(xì)胞形成的細(xì)胞球大小不等,而對(duì)照組的單細(xì)胞克隆沒(méi)有觀察到細(xì)胞球的形成。2.2免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果2.2.1各組控制形態(tài)的比較,見(jiàn)表1對(duì)照組和給藥組原代培養(yǎng)4d的細(xì)胞都有Nestin表達(dá),其陽(yáng)性細(xì)胞分為帶突起和不帶突起兩種,細(xì)胞大小不一,陽(yáng)性部位在細(xì)胞質(zhì)內(nèi),染色深呈棕色,胞體為圓形或橢圓,核區(qū)呈陰性且常偏移于細(xì)胞的一側(cè),有的細(xì)胞高倍鏡下可清楚見(jiàn)到染色體,突起多只有一條。給藥組Nestin陽(yáng)性細(xì)胞大多聚集呈團(tuán)狀,細(xì)胞團(tuán)內(nèi)的陽(yáng)性細(xì)胞多為大小不一的圓形無(wú)突起細(xì)胞,分中三種,細(xì)胞團(tuán)周邊的陽(yáng)性細(xì)胞大多帶有突起。對(duì)照組Nestin陽(yáng)性細(xì)胞與給藥組比數(shù)量較明顯減少,細(xì)胞體積較小,形成團(tuán)狀不明顯。(圖4)PCNA表達(dá)在細(xì)胞核內(nèi),呈深棕色,陽(yáng)性細(xì)胞核呈圓形、橢圓形或桿狀,其中以圓形和橢圓形居多,陽(yáng)性核大小不一,有時(shí)可見(jiàn)到兩個(gè)PCNA陽(yáng)性細(xì)胞核成對(duì)存在。給藥組PCNA陽(yáng)性細(xì)胞核的數(shù)量明顯多于對(duì)照組,反應(yīng)也明顯強(qiáng)于對(duì)照組。對(duì)照組PCNA陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量較少,且體積大多較小,染色較淺。(圖5)經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)和統(tǒng)計(jì)處理,給藥組Nestin和PCNA平均陽(yáng)性細(xì)胞個(gè)數(shù)分別比對(duì)照組明顯增多,有顯著性差異(P<0.01),具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(表1)2.2.2tuj1和nf陽(yáng)性細(xì)胞形態(tài)變化Tuj-1表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)內(nèi),呈深棕色,核區(qū)呈陰性且常偏移于細(xì)胞的一側(cè),高倍鏡下甚至可以見(jiàn)到核內(nèi)染色體。給藥組Tuj1陽(yáng)性細(xì)胞形態(tài)有的呈小的圓形,不帶突起,有的陽(yáng)性細(xì)胞胞體較大,呈圓形或橢圓形,帶有一個(gè)或多個(gè)突起,且陽(yáng)性細(xì)胞聚集成團(tuán)。對(duì)照組Tuj1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量比給藥組明顯減少,體積也明顯減小,且陽(yáng)性細(xì)胞成團(tuán)不明顯。(圖2)NF表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)內(nèi),呈深棕色,給藥組NF陽(yáng)性細(xì)胞形態(tài)呈圓形或橢圓形,帶有一個(gè)或多個(gè)突起。對(duì)照組NF陽(yáng)性細(xì)胞形態(tài)以小圓形無(wú)突起為主,少數(shù)細(xì)胞帶有突起,陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量比給藥組明顯減少。經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)和統(tǒng)計(jì)處理,給藥組Tuj-1和NF平均陽(yáng)性細(xì)胞個(gè)數(shù)分別多于比對(duì)照組明顯增多,有顯著性差異(P<0.01),具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(表1)2.2.3對(duì)gfap表達(dá)的影響Vimentin表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)內(nèi),呈深棕色,核區(qū)呈陰性且偏移于細(xì)胞的一側(cè),給藥組Vimentin陽(yáng)性細(xì)胞形態(tài)呈圓形或橢圓形,分大中小三種,帶有一個(gè)或多個(gè)突起,細(xì)胞成團(tuán)狀,由內(nèi)向外,細(xì)胞由小變大,突起也逐漸增多。對(duì)照組Vimentin陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量比中藥組明顯減少,細(xì)胞散在,體積較小,Vimentin陽(yáng)性細(xì)胞大多呈小圓形,帶有一個(gè)或多個(gè)突起。(圖6)GFAP表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)內(nèi),呈深棕色,給藥組GFAP陽(yáng)性細(xì)胞有的胞體較大,呈三角形,帶有多個(gè)突起,有的胞體較小,呈圓形或橢圓形,帶有一個(gè)或多個(gè)突起。對(duì)照組GFAP陽(yáng)性細(xì)胞胞體呈小圓形,大多帶有一個(gè)突起,少數(shù)帶有多個(gè)突起,細(xì)胞數(shù)量比給藥組明顯減少。經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)和統(tǒng)計(jì)處理,給藥組Vimentin和GFAP平均陽(yáng)性細(xì)胞個(gè)數(shù)均明顯多于對(duì)照組,有顯著性差異(P<0.01),具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(表1)2.2.4細(xì)胞陽(yáng)性細(xì)胞給藥和對(duì)照組原代培養(yǎng)4d的細(xì)胞都有bFGF和BDNF表達(dá),陽(yáng)性部位都在細(xì)胞質(zhì),且陽(yáng)性細(xì)胞形態(tài)也多為圓形或橢圓,部分細(xì)胞帶有1-2條突起,給藥組陽(yáng)性細(xì)胞聚集成團(tuán),帶突起的細(xì)胞多位于細(xì)胞團(tuán)周邊,給藥組bFGF和BDNF陽(yáng)性細(xì)胞明顯多于,反應(yīng)也明顯強(qiáng)于對(duì)照組,對(duì)照組bFGF和BDNF陽(yáng)性細(xì)胞一般分布疏松而成團(tuán)狀不明顯。(圖3,7)Differentfromcontrol**P<0.013神經(jīng)干細(xì)胞的特性神經(jīng)干細(xì)胞(neuralstemcell)是指具有多向分化潛能,即分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞的能力,能自我更新并足以提供大量腦組織細(xì)胞的細(xì)胞,所以自我更新和多向分化潛能是神經(jīng)干細(xì)胞的兩大基本特性。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示三七總皂甙在離體能夠促進(jìn)胎鼠皮層神經(jīng)干細(xì)胞的存活、增殖、自我更新,并促進(jìn)其分化為神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞。3.1皂茯苓對(duì)胎鼠皮質(zhì)細(xì)胞增殖的影響神經(jīng)上皮干細(xì)胞蛋白Nestin為一種中間絲蛋白,是胚胎神經(jīng)干細(xì)胞的特異性標(biāo)記,以往實(shí)驗(yàn)從胎鼠紋狀體、海馬、皮層成功分離了神經(jīng)干細(xì)胞,離體研究證實(shí)從中樞神經(jīng)系統(tǒng)任何部位分離培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞共有的特征是表達(dá)Nestin,并在營(yíng)養(yǎng)因子bFGF或EGF存在條件下具有持續(xù)增殖、自我更新和多向分化的能力,在一定條件下能夠分化為神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)分離培養(yǎng)的胎鼠皮層細(xì)胞表達(dá)Nestin,表明這些陽(yáng)性細(xì)胞是神經(jīng)干細(xì)胞,三七總皂甙促進(jìn)表達(dá)Nestin的神經(jīng)干細(xì)胞或前體細(xì)胞增多,可能一方面促進(jìn)其存活,另一方面促進(jìn)其增殖和自我更新產(chǎn)生更多的具有前體細(xì)胞特性未分化的Nestin陽(yáng)性細(xì)胞,PCNA表達(dá)的增多說(shuō)明三七總皂甙確實(shí)能夠促進(jìn)胎鼠皮層細(xì)胞的增殖,PCNA是一種分子量為36Kda,涉及DNA復(fù)制和DNA修復(fù)的蛋白質(zhì),是DNA多聚酶δ和ε完整功能必需的一種輔助因子,這里標(biāo)記增殖分裂的細(xì)胞。Nestin陽(yáng)性細(xì)胞形態(tài)大小不一,提示它們未分化的程度可能不同,細(xì)胞核偏移、沒(méi)有或只有一條細(xì)突起也反應(yīng)其處于較原始階段。3.2神經(jīng)球細(xì)胞形成細(xì)胞神經(jīng)干細(xì)胞能不斷持續(xù)分裂產(chǎn)生更多仍具有干細(xì)胞特性的未分化子代細(xì)胞,這就是神經(jīng)干細(xì)胞的自我更新,這一特性可通過(guò)離體實(shí)驗(yàn)很好證明,學(xué)者們發(fā)現(xiàn)離體培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞在營(yíng)養(yǎng)因子bFGF或EGF作用下可以形成由很多細(xì)胞組成的細(xì)胞團(tuán),稱之為神經(jīng)球(Neurosphere),將神經(jīng)球細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞克隆,在bFGF或EGF作用下又可以形成神經(jīng)球,而且神經(jīng)球細(xì)胞可同時(shí)被誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞(包括星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞),將單細(xì)胞克隆形成的神經(jīng)球細(xì)胞再進(jìn)行單細(xì)胞的亞克隆,又能夠形成具有多向分化潛能的神經(jīng)球,如此可連續(xù)很多代,說(shuō)明這些細(xì)胞具有自我更新和多向分化的潛能,因此就離體而言,又將神經(jīng)干細(xì)胞稱為神經(jīng)球形成細(xì)胞。研究還表明神經(jīng)球在懸浮生長(zhǎng)條件下容易形成,神經(jīng)球細(xì)胞都表達(dá)Nestin。給藥組的原代以及P1、P2細(xì)胞中都有較多的細(xì)胞球形成,在三七總皂甙作用下P1細(xì)胞的單細(xì)胞克隆又能夠形成細(xì)胞球以及免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果的Nestin陽(yáng)性細(xì)胞團(tuán)狀分布,說(shuō)明這些細(xì)胞球就是由自我更新的神經(jīng)干細(xì)胞形成的神經(jīng)球,細(xì)胞團(tuán)及細(xì)胞球大小的不等,說(shuō)明其原始程度和自我更新能力不同,三七總皂甙促進(jìn)了它們的自我更新和自我維持。3.3tuj-1、nf陽(yáng)性神經(jīng)元和gfap陽(yáng)性神經(jīng)元的形成細(xì)胞神經(jīng)干細(xì)胞具有多向分化潛能,可同時(shí)分化為神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞,三七總皂甙能夠促進(jìn)胎鼠皮層神經(jīng)干細(xì)胞同時(shí)分化為T(mén)uj-1、NF陽(yáng)性的神經(jīng)元和Vimentin、GFAP陽(yáng)性的膠質(zhì)細(xì)胞,陽(yáng)性細(xì)胞聚集成團(tuán),其組成細(xì)胞大小不等,提示它們可能還未充分成熟,處于分化的不同階段,細(xì)胞團(tuán)中央的細(xì)胞相對(duì)幼稚,為圓形、不帶有突起;細(xì)胞團(tuán)周邊細(xì)胞相對(duì)分化程度較高、較成熟,而胞體較大、多帶有突起。3.4促進(jìn)神經(jīng)胞質(zhì)細(xì)胞分化的藥物作用本研究結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較三七總皂甙促進(jìn)了bFGF、BDNF在原代培養(yǎng)胎鼠皮層細(xì)胞中的表達(dá)。神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖、分化起著重要的調(diào)控作用,神經(jīng)干細(xì)胞必須在神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子如bFGF和EGF存在下才能存活和不斷增殖,其中bFGF是促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增