腫瘤的免疫細(xì)胞療法摘要:隨著人們壽命的增加，癌癥逐漸成為了人類死亡的主要原因之一。針對(duì)癌癥的治療也一直是全球的研究熱點(diǎn)。傳統(tǒng)治療腫瘤的手術(shù)療法，放療，化療并不能從根本上消滅腫瘤細(xì)胞,往往有很高的復(fù)發(fā)率。而腫瘤的免疫療法為治愈癌癥帶來了新的希望。本文對(duì)免疫療法發(fā)展過程中出現(xiàn)的各種細(xì)胞療法進(jìn)行了介紹。關(guān)鍵詞：免疫療法LAKTILCIKDC-CIKCAR-T根據(jù)世界衛(wèi)生組織2014年世界癌癥報(bào)告，癌癥是全球主要原因死亡原因之一,2012年約新增癌癥病例1400萬，癌癥相關(guān)死亡病例820萬。面對(duì)嚴(yán)峻的形勢(shì)，全球投入了大量的人力和資源研究腫瘤產(chǎn)生機(jī)制以及預(yù)防和治療的方法。一直以來,腫瘤的臨床治療手段主要是手術(shù)、放療和化療，雖然有一定的效果，但很難從根本上達(dá)到治療和控制腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的目的。近年來，腫瘤的免疫療法的發(fā)展為解決這一難題帶來了希望。免疫療法的根源可以上溯到1897年，化學(xué)治療的建立者PaulEhrlich提出“魔術(shù)子彈”概念(magicbulletconcept)1。他認(rèn)為,靶向藥物理論上能夠有效地攻擊病原體而對(duì)健康的組織無害，并且提出免疫系統(tǒng)能夠防止腫瘤發(fā)生，抗體是一種能確定目標(biāo)而不傷害機(jī)體的“魔術(shù)子彈”。然而他并沒在腫瘤細(xì)胞上找到特定的免疫原性受體。因此癌癥的研究也沒有成為他的主要工作。Ehrlich提出的靶向治療理念并不是嚴(yán)格上的免疫療法，因?yàn)楹芏嗷瘜W(xué)藥物對(duì)于生物分子或細(xì)胞也有靶向的作用，直到1875年“雜交瘤”制備單克隆抗體技術(shù)的發(fā)明2才奠定了免疫療法的基礎(chǔ)。免疫療法的另一基石是Burnet和Thomas提出"免疫監(jiān)視”(immunesurveillance)概念。他們認(rèn)為免疫系統(tǒng)一直在監(jiān)視著體內(nèi)的各種細(xì)胞，一旦出現(xiàn)癌變就會(huì)啟動(dòng)殺傷功能，而腫瘤的發(fā)生是免疫系統(tǒng)失調(diào)造成的3。然而裸鼠模型的研究發(fā)現(xiàn)，免疫系統(tǒng)缺陷的小鼠腫瘤發(fā)生率并未顯著提高4。這一發(fā)現(xiàn)打擊了“免疫監(jiān)視”概念，也使得免疫療法的發(fā)展出現(xiàn)了停滯。但隨著眾多腫瘤特異性抗原的發(fā)現(xiàn)和T細(xì)胞受體(Tcellreceptor,TCR)5、共刺激因子6、抗原提呈細(xì)胞(antigen-presentingcell,APC)7等免疫作用機(jī)制的發(fā)現(xiàn)是免疫治療的研究再次得到發(fā)展。臨床上第一次利用單克隆抗體治療腫瘤是1980年，通過對(duì)非霍奇金淋巴瘤患者靜脈注射單抗，腫瘤細(xì)胞的生長暫時(shí)被抑制8。自1997年第一個(gè)抗腫瘤抗體藥物Rituximab9被批準(zhǔn)上市后，目前已有約250種藥物上市或臨床在研10。除了直接注射抗體、細(xì)胞因子等激活人體自身免疫系統(tǒng)外，還有一類免疫療法通過直接向病人輸入激活的免疫細(xì)胞來治療癌癥，又稱為“免疫細(xì)胞療法”或“細(xì)胞療法”。免疫細(xì)胞療法到目前為止至少有以下五種類型：淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞(lymphokineactivatedkillercells,LAKcells)療法LAK細(xì)胞首次發(fā)現(xiàn)是通過腫瘤患者外周淋巴細(xì)胞在含有高劑量的白介素-2(interleukin-2,IL-2)的培養(yǎng)液中短期培養(yǎng)誘導(dǎo)產(chǎn)生,能夠殺傷新鮮分離的實(shí)體瘤細(xì)胞和體外培養(yǎng)的瘤細(xì)胞11。LAK是一種T細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞(naturalkillercells,NKcells)組成的混合物。在體外實(shí)驗(yàn)中，這兩種細(xì)胞都表現(xiàn)出了對(duì)于廣譜腫瘤細(xì)胞的非主要組織相容性復(fù)合體限制性(non-majorhistocompatibilitycomplex-restricted,non-MHC-restricted)的細(xì)胞毒性12。將癌癥病人的外周淋巴細(xì)胞體外誘導(dǎo)擴(kuò)增成LAK細(xì)胞回輸后,腫瘤出現(xiàn)消退13。LAK細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞的機(jī)制一般認(rèn)為有三種:與靶細(xì)胞結(jié)合釋放后通過分泌細(xì)胞釋放毒顆粒,直接殺傷腫瘤細(xì)胞;通過LAK細(xì)胞表面的殺傷分子直接殺傷腫瘤細(xì)胞；通過分泌細(xì)胞因子引發(fā)免疫反應(yīng)殺傷腫瘤細(xì)胞14。LAK殺傷機(jī)制十分復(fù)雜,甚至不同克隆的LAK細(xì)胞的機(jī)制也不完全相同，這位它的應(yīng)用帶來了限制。此外,LAK細(xì)胞在體內(nèi)雖然有一定的殺傷腫瘤的作用,但也有很大的副作用，如血管滲漏、嚴(yán)重低血壓1516。目前這一方法已基本被淘汰。腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞(tumor-infiltratinglymphocytes,TIL)療法1863年,RudolfVirchow首次在腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)淋巴細(xì)胞17。Zettergren第一次從腫瘤組織中分離出淋巴細(xì)胞18。從多種小鼠腫瘤中分離培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞被證明有體內(nèi)抗腫瘤活性19。TIL細(xì)胞具有良好的腫瘤特異性，主要作用于CD3+CD56-CD8+的細(xì)胞,只能殺死自體同源的腫瘤細(xì)胞而對(duì)于不同MHC的腫瘤沒有效果。對(duì)黑色素瘤病人的臨床試驗(yàn)表明,TIL比LAK具有更好的抗腫瘤活性20。利用自體同源的TIL細(xì)胞的治療能夠在黑色素瘤病人體內(nèi)產(chǎn)生持久完整的應(yīng)答，這一效應(yīng)與前期的治療無關(guān)21。過去十年間,TIL療法的作用機(jī)制得到了很好的闡明，尤其是宿主淋巴缺失的條件22,輸入的TIL細(xì)胞存活因子IL-2的作用23以及回輸細(xì)胞的最優(yōu)佳質(zhì)量與數(shù)量24。然而這一療法的應(yīng)用仍大部分局限于黑色素瘤，此外，困難的體外擴(kuò)增和較低的體內(nèi)抗腫瘤活性也限制了這一療法的發(fā)展和應(yīng)用。細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(cytokine-inducedkillercells,CIKcells)療法CIK細(xì)胞是是一類體外誘導(dǎo)產(chǎn)生的異質(zhì)細(xì)胞，兼具T細(xì)胞的抗腫瘤活性和NK細(xì)胞非特異性殺瘤特點(diǎn),通過刺激和恢復(fù)免疫系統(tǒng)對(duì)腫瘤細(xì)胞識(shí)別和殺傷25。與LAK細(xì)胞類似,CIK細(xì)胞也是通過體外培養(yǎng)外周血淋巴細(xì)胞產(chǎn)生，除了添加IL-2外，CIK細(xì)胞的誘導(dǎo)還添加了一些其他因子，如IL-1,IFN-y,Abanti-CD326。相對(duì)于LAK細(xì)胞和TIL細(xì)胞,CIK細(xì)胞具有更好的抗腫瘤性,更小的副作用，更好的體外擴(kuò)增性，更廣譜殺瘤性。CIK細(xì)胞抗腫瘤的機(jī)制目前認(rèn)為有以下幾點(diǎn)：1、 直接殺傷作用。CIK對(duì)靶細(xì)胞的殺傷可能有兩種途徑。一是CIK在淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原-1(lymphocytefunctionassociatedantigen-1,LFA-1)的識(shí)別結(jié)構(gòu)的激活下引發(fā)細(xì)胞質(zhì)毒顆粒依賴的溶細(xì)胞作用；另一種是CIK表面的CD3樣受體被結(jié)合后引發(fā)細(xì)胞質(zhì)毒顆粒依賴的溶細(xì)胞作用27。2、 分泌細(xì)胞因子。CIK細(xì)胞能分泌IFN-y、TNF、IL-2等多種細(xì)胞因子。這些細(xì)胞因子可通過調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)或直接抑制腫瘤細(xì)胞。針對(duì)慢性淋巴白血病的治療發(fā)現(xiàn),CIK細(xì)胞分泌的IFN-y能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞ICAM-1的表達(dá)，從而增強(qiáng)CIK的識(shí)別和殺傷能力28。3、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。有研究表明，在CIK培養(yǎng)過程中表達(dá)的Fas配體能抵抗FasL+腫瘤細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡，同時(shí)能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡29。針對(duì)胃癌的研究中也發(fā)現(xiàn)CIK能夠下調(diào)P53、C-myc和Bcl-2的表達(dá)，上調(diào)Bax的表達(dá)，從而早期誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，晚期誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞壞死30。CIK細(xì)胞療法存在的問題是對(duì)于不同類型的腫瘤很難有相同的療效，目前也沒有一種可靠的方法來預(yù)測(cè)其有效性。此外，這種療法仍然存在移植物抗宿主的問題。較為復(fù)雜和昂貴的制備條件使其還是一種輔助的療法。樹突狀細(xì)胞-細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(dendriticcellsandcytokine-inducedkillercells,DC-CIK)聯(lián)合療法DC-CIK療法是CIK療法的一種優(yōu)化，將DC于CIK細(xì)胞共同培養(yǎng)產(chǎn)生。DC細(xì)胞是目前已知的功能最強(qiáng)大的專職抗原提呈細(xì)胞，可以表達(dá)的MHC-I,MHC-II以及CD1分子提呈腫瘤抗原,有效對(duì)抗腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸,同時(shí)能夠分泌IL-2激活T細(xì)胞的免疫應(yīng)答31。DC同時(shí)也是一種具有抗腫瘤能力的細(xì)胞,其作用機(jī)制為:誘導(dǎo)產(chǎn)生大量效應(yīng)T細(xì)胞后引導(dǎo)效應(yīng)T細(xì)胞遷移到腫瘤部位，并維持效應(yīng)T細(xì)胞在腫瘤部位的長期存在,DC同時(shí)能夠分泌IL-12,TNF等細(xì)胞因子促進(jìn)腫瘤殺傷;此外,DC還能夠抑制腫瘤血管的生成，進(jìn)而抑制腫瘤的生長32。雖然DC和CIK細(xì)胞都具有抗腫瘤作用，但臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)效果并不理想。DC能夠識(shí)別抗原，引發(fā)獲得性免疫應(yīng)答并激活效應(yīng)T細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞而CIK能夠發(fā)揮自身細(xì)胞毒性同時(shí)分泌細(xì)胞因子殺傷腫瘤細(xì)胞,于是有人設(shè)想將兩種細(xì)胞聯(lián)合起來協(xié)同治療惡性腫瘤。實(shí)驗(yàn)研究顯示,DC-CIK共培養(yǎng)的抗腫瘤性顯著高于單獨(dú)的CIK細(xì)胞33。CD-CIK聯(lián)合療法具有以下特點(diǎn):CIK細(xì)胞在DC的刺激下抗腫瘤活性顯著提高;CIK細(xì)胞的增殖能力顯著提高;CIK細(xì)胞能夠促進(jìn)DC細(xì)胞的成熟;DC與CIK共培養(yǎng)可減少CIK細(xì)胞群中免疫抑制T細(xì)胞的數(shù)量，降低腫瘤的免疫抑制作用34。目前針對(duì)肺癌、白血病、腎癌、胰腺癌等多種惡性腫瘤的臨床研究顯示,DC-CIK都是患者病情得到不同程度的緩解35。雖然DC與CIK細(xì)胞共培養(yǎng)提高了細(xì)胞的增殖速度和抗腫瘤活性，但目前缺乏可靠的大規(guī)模的臨床病例來證明其療效，相關(guān)研究還在進(jìn)行。值得一提的是,CIK療法和DC-CIK療法相關(guān)的臨床研究研究和實(shí)驗(yàn)大多在中國進(jìn)行36。嵌合抗原受體T細(xì)胞(chimericantigenreceptorTcell,CAR-T)免疫療法CAR-T療法近幾年突飛猛進(jìn)，逐漸進(jìn)入大眾的眼中,甚至有報(bào)道說“從此治愈癌癥不是夢(mèng)”。很多人認(rèn)為這是一項(xiàng)新的治療技術(shù)。實(shí)際上，早在1989年,Gross等人在研究中用抗體的一條重鏈(VH)和一條輕鏈(VL)替換了T細(xì)胞受體(Tcellreceptor,TCR)的a鏈和。鏈，形成了抗體-TCR嵌合分子，他們講這個(gè)分子的編碼基因轉(zhuǎn)入到T細(xì)胞中后發(fā)現(xiàn)其獲得了抗體的特異識(shí)別能力，這種編碼基因被稱為嵌合T細(xì)胞受體(chimericT-cellreceptor,TcR)37。這一結(jié)構(gòu)也是CAR-T中嵌合抗原受體(chimericantigenreceptor,CAR)結(jié)構(gòu)的雛形。在這一結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上,CAR結(jié)構(gòu)不斷被優(yōu)化。目前,經(jīng)典的CAR結(jié)構(gòu)包含五個(gè)部分:單鏈可變區(qū)(single-chainvariablefragment,scFv),鉸鏈區(qū)，跨膜區(qū)，共刺激區(qū)和T細(xì)胞活化區(qū)。其中scFv能夠識(shí)別指定的抗原。目前,CAR-T已經(jīng)發(fā)展出了四代:第一代CAR-T就是Gross等人在TcR基礎(chǔ)上改造的將scFv與免疫細(xì)胞FcRy鏈或CD3Z鏈融合形成38。這種T細(xì)胞雖然能夠接到腫瘤殺傷,但無法轉(zhuǎn)導(dǎo)增殖信號(hào)，誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞因子，在體內(nèi)作用時(shí)間不長。隨后發(fā)展出的第二代CAR-T技術(shù)引入了一個(gè)共刺激因子39。這些共刺激因子能夠發(fā)揮不同的作用，如誘導(dǎo)增殖，產(chǎn)生細(xì)胞因子等，延長了CAR-T細(xì)胞的體內(nèi)作用時(shí)間。目前進(jìn)行臨床研究的多位第二代。第三代CAR-T技術(shù)在第二代的基礎(chǔ)上將共刺激區(qū)增加為兩個(gè)40,進(jìn)一步延長了CAR-T的作用時(shí)間和抗腫瘤活性。第四代CAR-T在原有基礎(chǔ)上，增加了表達(dá)能夠招募免疫系統(tǒng)其他成分的細(xì)胞因子，如IL-1241,從而放大抗腫瘤免疫效應(yīng)。CAR-T療法的主要特點(diǎn)是通過基因工程的方法使T細(xì)胞表達(dá)識(shí)別腫瘤特異性抗原的受體,從而使T細(xì)胞對(duì)腫瘤有高親和性，同時(shí)在對(duì)腫瘤特異性識(shí)別后引發(fā)細(xì)胞內(nèi)的通路釋放細(xì)胞因子殺傷腫瘤。此外,CAR-T細(xì)胞在輸入體內(nèi)后能夠主動(dòng)遷移到腫瘤部位，能自我增殖，能釋放細(xì)胞因子,能發(fā)生溶瘤作用以及能作為記憶細(xì)胞長期存在的特性使其能夠成為一種成功地繼承性細(xì)胞免疫療法。CAR-T治療具體包括以下幾個(gè)步驟：1、從病人外周血中獲得充足的T細(xì)胞;2、利用安全而有效的遺傳學(xué)材料將CAR基因轉(zhuǎn)入T細(xì)胞;3、轉(zhuǎn)入CAR基因的T細(xì)胞體外擴(kuò)增到足夠的數(shù)量;4、回輸CAR-T細(xì)胞;5、嚴(yán)密監(jiān)視不良反應(yīng)。前三代的CAR-T療法需要對(duì)患者進(jìn)行清髓治療,一般為大劑量化療，以清除免疫抑制細(xì)胞。這一過程往往給患者帶來很大的傷害。第四代CAR-T技術(shù)通過分泌IL-12解決了這一問題42,避免了清髓治療的毒副作用。雖然CAR-T療法在抗腫瘤性上很強(qiáng)大，但同時(shí)也帶來了同樣大的風(fēng)險(xiǎn)和副作用。由于CAR-T本身的強(qiáng)大殺傷能力，最大的風(fēng)險(xiǎn)因素就是脫靶效應(yīng)。由于絕大多數(shù)的CAR定向抗原并非腫瘤特有的，一般選擇抗原在腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)但在正常組織細(xì)胞中也有不同程度的表達(dá),CAR-T很可能會(huì)損傷這些正常組織。針對(duì)這一問題，可能的解決方法是找到只在腫瘤中表達(dá)的抗原或者通過使用兩種不同的CAR,只有同時(shí)結(jié)合抗原才能引起免疫應(yīng)答來避免只表達(dá)部分抗原的正常組織受損43。此外，這一療法產(chǎn)生的“細(xì)胞因子風(fēng)暴”是需要嚴(yán)密監(jiān)視的副作用。由于CAR結(jié)構(gòu)中引入了共刺激因子，治療過程中多種細(xì)胞因子會(huì)釋放到循環(huán)系統(tǒng)中，引起惡心、頭痛、高燒、低血壓等體征，嚴(yán)重的可導(dǎo)致死亡44。由于這一過程目前不可避免，只能采取控制輸入CAR-T細(xì)胞數(shù)量，輸入后嚴(yán)密監(jiān)控病人狀態(tài)來減小這一效應(yīng)帶來的危險(xiǎn)。目前,CAR-T的治療主要是以血液瘤為主，對(duì)于實(shí)體瘤的研究雖然有很多，但進(jìn)展并不順利。其主要原因是實(shí)體瘤不是游離的,CAR-T必需侵入實(shí)體瘤內(nèi)部發(fā)揮作用，而腫瘤所處的微環(huán)境具有強(qiáng)烈的免疫抑制作用，不利于CAR-T的生存和維持。CAR-T的進(jìn)一步發(fā)展需要找到更具有特異性的抗原，加強(qiáng)CAR-T向腫瘤部位的遷移能力，同時(shí)要優(yōu)化其安全性。此外，還可以將CAR結(jié)構(gòu)運(yùn)用于其他的免疫細(xì)胞，通過多種免疫細(xì)胞的聯(lián)合作用加強(qiáng)抗腫瘤性。腫瘤治療最大的兩個(gè)問題是藥物的靶向性和腫瘤的免疫抑制性。免疫細(xì)胞療法的發(fā)展逐漸解決了靶向問題一一只需找到合適的抗原，而腫瘤的免疫抑制性需要通過有效的藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞相關(guān)的通路進(jìn)行阻斷。將兩者結(jié)合起來,治愈癌癥的夢(mèng)想一定能夠?qū)崿F(xiàn)。1StrebhardtK,UllrichA.PaulEhrlich’smagicbulletconcept:100yearsofprogress.NatRevCancer,2008,8(6):473-480.2K?hlerG,MilsteinC.Continuousculturesoffusedcellssecretingantibodyofpredefinedspecificity.Nature,1975,256(5517):495-497.3BurnetM.Cancer:Abiologicalapproach.I.Theprocessesofcontrol.BrMedJ,1957,1:779-7864StutmanO.Tumordevelopmentafter3-methylcholanthreneinimmunologicallydeficientathymicnudemice.Science,1974,183:534-5365McIntyreBW,AllisonJP.ThemouseTcellreceptor