PCR引物設(shè)計(jì)原理PCR引物設(shè)計(jì)原理PCR反應(yīng)一般由三個(gè)步驟組成：①模板的熱變性；②引物復(fù)性到單鏈模板上；③熱穩(wěn)定DNA聚合酶催化的延伸PCR引物設(shè)計(jì)原理PCR引物設(shè)計(jì)原理變性在應(yīng)用TaqDNA聚合酶進(jìn)行PCR時(shí)，變性溫度在94-95℃下進(jìn)行，這也是TaqDNA聚合酶進(jìn)行30個(gè)或30個(gè)以上PCR循環(huán)而活力不受到過(guò)多損失時(shí)能耐受的最高溫度。有時(shí)把變性時(shí)間設(shè)計(jì)為5min，以便大分子模板DNA徹底變性的概率。對(duì)于GC含量為55%或更低的線性DNA模板，推薦PCR的變性條件是94-95℃變性45s。PCR引物設(shè)計(jì)原理復(fù)性溫度（退火溫度）至關(guān)重要?。?！退火溫度太高，引物不能與模板很好地復(fù)性，擴(kuò)增效率會(huì)非常低；退火溫度太低，引物將產(chǎn)生非特異性復(fù)性，從而導(dǎo)致非特異性DNA片段的擴(kuò)增；退火溫度，通常比理論設(shè)計(jì)的引物和模板的Tm值低3-5℃下進(jìn)行。最好通過(guò)對(duì)復(fù)性溫度比兩條引物的Tm值低2-10℃內(nèi)進(jìn)行PCR預(yù)實(shí)驗(yàn)（梯度）來(lái)對(duì)復(fù)性條件的優(yōu)化。引物和模板DNA的復(fù)性PCR引物設(shè)計(jì)原理對(duì)TaqDNA聚合酶來(lái)說(shuō)，最適溫度為72-78℃，時(shí)間約為1min。引物的延伸與循環(huán)數(shù)目哺乳動(dòng)物DNA為模板時(shí)，至少進(jìn)行25個(gè)循環(huán)才能得到足夠量的擴(kuò)增產(chǎn)物。一般為30-33個(gè)循環(huán)。PCR引物設(shè)計(jì)原理引物設(shè)計(jì)要點(diǎn)（1）堿基組成：GC含量應(yīng)在40%-60%（45%-55%）之間，4中堿基在引物中分配均勻。沒(méi)有多聚嘌呤或多聚嘧啶序列，如AAAAA等，沒(méi)有二核苷酸重復(fù)序列，如GCGCGC等；（2）引物長(zhǎng)度：引物中與模板互補(bǔ)的區(qū)應(yīng)為18-25個(gè)核苷酸長(zhǎng)度，上下引物長(zhǎng)度差別不能大于3bp，如上游引物為19bp，下游引物為24bp等。PCR引物設(shè)計(jì)原理（3）重復(fù)或自身互補(bǔ)序列：形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，會(huì)阻止引物和模板之間的復(fù)性。PCR引物設(shè)計(jì)原理（4）上下引物的互補(bǔ)性：一個(gè)引物的3'末端序列不允許結(jié)合到另一個(gè)引物的任何位點(diǎn)上，因?yàn)镻CR中引物濃度較高，會(huì)形成引物二聚體。當(dāng)一個(gè)PCR有多對(duì)引物時(shí)，注意檢查任何一個(gè)3'末端都不能和其他任何引物互補(bǔ)。PCR引物設(shè)計(jì)原理（5）解鏈溫度（Tm值）：計(jì)算出來(lái)的兩個(gè)引物的Tm值相差不能大于5℃，擴(kuò)增產(chǎn)物的Tm值與引物的Tm值相差不能大于10℃；引物的Tm值一般為50-70℃。這些特性保證了擴(kuò)增產(chǎn)物在每一個(gè)PCR循環(huán)可有效變性。PCR引物設(shè)計(jì)原理（6）3’末端3’末端的性質(zhì)非常關(guān)鍵。如果可能的話，每個(gè)引物的3’末端堿基為G或C；最好不要A，或AA等多聚A；但不推薦3’末端有….NNNCG或…..NNNGC序列的引物，GC高自由能促進(jìn)發(fā)夾及引物二聚體產(chǎn)生。PCR引物設(shè)計(jì)原理當(dāng)末端堿基為A時(shí)，錯(cuò)配時(shí)引發(fā)鏈合成的效率大大降低；當(dāng)末端堿基為T(mén)時(shí)，錯(cuò)配情況下亦能引發(fā)鏈的合成，所以一般PCR反應(yīng)中，引物3’末端的堿基最好選T、C、G，而不選A。引物3′端錯(cuò)配時(shí)，不同堿基引發(fā)效率存在著很大的差異，當(dāng)末位的堿基為A時(shí)，即使在錯(cuò)配的情況下，也能有引發(fā)鏈的合成，而當(dāng)末位鏈為T(mén)時(shí)，錯(cuò)配的引發(fā)效率大大降低，G、C錯(cuò)配的引發(fā)效率介于A、T之間，所以3′端最好選擇T。？？（7）5’端序列添加限制性酶切位點(diǎn)：PCR引物設(shè)計(jì)原理一些概念有意鏈（Sensestrand），正義鏈（positivestrand），編碼鏈（codingstrand）；無(wú)意鏈（anti-sensestrand），負(fù)義鏈（negativestrand），模板鏈（templatestrand）

PCR引物設(shè)計(jì)原理正向引物（forwardprimer）：處于DNA雙鏈上游的引物。如用于測(cè)序，則從5’→3’方向讀出DNA正鏈的序列。反向引物（Reverseprimer）：處于目的DNA雙鏈下游的引物。如用于測(cè)序，則讀出DNA負(fù)鏈從下游到上游的反向序列。

PCR引物設(shè)計(jì)原理

PCR引物設(shè)計(jì)原理PrimerPremier5.0軟件設(shè)計(jì)引物是由加拿大的Premier公司開(kāi)發(fā)的專業(yè)用于PCR或測(cè)序引物以及雜交探針的設(shè)計(jì)、評(píng)估的軟件主要界面分為序列編輯窗口（genetank）、primerdesign、酶切分析（restrictionsite）和MotifPCR引物設(shè)計(jì)原理正向（Asis）、反向（reversed）、互補(bǔ)（complemented）及反向互補(bǔ)（reversecomplemented）。PCR引物設(shè)計(jì)原理正向（Asis）PCR引物設(shè)計(jì)原理反向（reversed）PCR引物設(shè)計(jì)原理互補(bǔ)（complemented）PCR引物設(shè)計(jì)原理EnzymePCR引物設(shè)計(jì)原理軟件默認(rèn)以表格方式顯示酶切結(jié)果。單擊Seq或Map，分別以序列或圖示的方式顯示結(jié)果。缺點(diǎn)：不能以文本的形式保存結(jié)果。PCR引物設(shè)計(jì)原理Motif

PCR引物設(shè)計(jì)原理PCR引物設(shè)計(jì)原理PrimerPCR引物設(shè)計(jì)原理點(diǎn)擊Search，進(jìn)行引物搜索PCR引物設(shè)計(jì)原理Searchcriteria窗口：多種參數(shù)可以調(diào)整。PrimerLength常設(shè)置在18－30bp,短了特異性不好，長(zhǎng)了沒(méi)有必要。當(dāng)然有特殊要求的除外，如加個(gè)酶切位點(diǎn)什么的。PCRProductsize最好是100－500bp之間，小于100bp的PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳出來(lái)，條帶很模糊，不好看。至于上限倒也不必要求苛刻。PCR引物設(shè)計(jì)原理Manual→Searchparameters→人工搜索參數(shù)設(shè)置窗口。Searchstringency應(yīng)選High。GC含量一般是40－60％。其它參數(shù)默認(rèn)就可以。PCR引物設(shè)計(jì)原理Searchprogress窗口中顯示SearchCompleted→OK鍵PCR引物設(shè)計(jì)原理結(jié)果窗口→有三種顯示形式，上游引物、下游引物和成對(duì)顯示。引物按優(yōu)劣次序排列，滿分為100。選其中的一對(duì)引物，在主窗口顯示結(jié)果。對(duì)于上述引物，如果其它各項(xiàng)指標(biāo)還可以，可在引物末端去掉一個(gè)不滿意的或加上一個(gè)堿基，看看引物的評(píng)估參數(shù)有沒(méi)有變好點(diǎn)。搜索出來(lái)的引物，按Rating排序，逐個(gè)送Oligo軟件里評(píng)估。當(dāng)然，搜索出的引物，其擴(kuò)增產(chǎn)物很短，你可以不選擇它。引物3端≥2個(gè)A或T,或引物內(nèi)部連續(xù)的G或C太多，或引物3端≥2個(gè)G或C，這樣的引物應(yīng)作為次選，沒(méi)得選了就選它。PCR引物設(shè)計(jì)原理該圖分為四部分：最上面是圖示模板及產(chǎn)物位置，“S”和“A”可查看有義鏈或反義鏈的引物。右邊是兩個(gè)引物在模板上結(jié)合位置的直觀圖；第二層是模板及引物序列的配對(duì)情況；第三層顯示引物的各種參數(shù)。注意：尾末給出該引物的最佳退火溫度！！第四層：四種重要指標(biāo)的分析PCR引物設(shè)計(jì)原理引物長(zhǎng)度：控制著引物的特異性和在PCR反應(yīng)中的退火溫度。長(zhǎng)的PCR引物能給擴(kuò)增帶來(lái)更好的特異性，可以通過(guò)降低退火溫度提高反應(yīng)的靈敏度，不過(guò)長(zhǎng)引物易形成包括發(fā)夾結(jié)構(gòu)二聚體自身互補(bǔ)等二級(jí)結(jié)構(gòu)。適宜引物長(zhǎng)度為18-27nt。Tm融鏈溫度：根據(jù)相鄰二堿基對(duì)作用原理來(lái)計(jì)算融鏈溫度。PCR反應(yīng)的合適Tm范圍為56-63℃（50-70℃）GC%含量：對(duì)于PCR反應(yīng)來(lái)說(shuō)GC含量在50%左右比較合適。（40-60%,45-55%）Degeneracy多義性，盡量減少引物多義性，這樣會(huì)帶來(lái)更好的特異性，盡量避免3’末端的多義性，因?yàn)檫@個(gè)位置即使一個(gè)堿基的錯(cuò)配都能阻止引物延伸。

PCR引物設(shè)計(jì)原理BLAST驗(yàn)證引物進(jìn)入http://,點(diǎn)擊BasicBLAST中的nucleotideblast選項(xiàng)PCR引物設(shè)計(jì)原理在EnterQuerySequence欄中輸入引物序列：例：引物為5’-CTGAGATCCTGAGCCTTTGG-3’;

5’-TGCCCATCACAACATCATCT-3’同時(shí)輸入上下游引物。輸入上下游引物都從5’→3’。輸入上游引物后，加上≥20個(gè)字母n，再輸入下游引物。PCR引物設(shè)計(jì)原理在ChooseSearchSet欄中：Database根據(jù)預(yù)操作基因的種屬定了，可選Humangenomic+transcript或OthersPCR引物設(shè)計(jì)原理在ProgramSelection中：選擇Somewhatsimilarsequences(blastn)項(xiàng)，如下圖：在此界面最下面關(guān)鍵要點(diǎn)擊Algorithmparameters參數(shù)設(shè)置，進(jìn)入?yún)?shù)設(shè)置界面。PCR引物設(shè)計(jì)原理在GeneralParameters中：Expectthresshold期望閾值須改為1000，大于1000也可以；在Wordsize的下拉框?qū)?shù)字改為7。PCR引物設(shè)計(jì)原理圖中：序列與引物匹配的得分值小于40分、40～50分、50-80分、80-200分等，分值越高，特異性越好；線段代表上或下游引物，其顏色和上面對(duì)照后就可得出該條引物的分值。兩線段間沒(méi)有連線的，表示單條引物與該基因一致。有連線的代表這些序列與上游引物匹配（Strand=Plus/Plus）、并與下游引物互補(bǔ)（Strand=Plus/Minus），理論上可以擴(kuò)增出基因片斷。點(diǎn)擊線段，就能跳轉(zhuǎn)到該基因的結(jié)果信息概要。PCR引物設(shè)計(jì)原理Accession，數(shù)據(jù)庫(kù)系列的身份證：點(diǎn)擊之后可以獲得該序列的信息Desscription序列的簡(jiǎn)單描述高的就是有兩線段間有連線的代表隨機(jī)匹配的可能性。E值接近零時(shí)最有意義，也就是說(shuō)序列完全匹配了。PCR引物設(shè)計(jì)原理比對(duì)到的序列長(zhǎng)度E值越小為好??！匹配上的堿基數(shù)占總序列長(zhǎng)度的比例缺失或插入，用“-”來(lái)表示Query1、2表示輸入的兩對(duì)引物，Sbjct表示在庫(kù)里比對(duì)的序列PrimerBLAST的詳細(xì)結(jié)果PCR引物設(shè)計(jì)原理ncbi在線primer設(shè)計(jì)PCR引物設(shè)計(jì)原理默認(rèn)的參數(shù)實(shí)際上是從100到1000，這個(gè)你得自己改，如果你希望產(chǎn)物的大小符合你的預(yù)期，盡可能把范圍改小，比如480-500至于RT-PCR所用的引物，最好是使得產(chǎn)物跨過(guò)內(nèi)含子，這樣避免潛在DNA對(duì)RT-PCR的干擾。

PCR引物設(shè)計(jì)原理PCR引物設(shè)計(jì)原理PCR引物設(shè)計(jì)原理PCR引物設(shè)計(jì)原理用Oligo軟件設(shè)計(jì)/評(píng)估PCR引物啟動(dòng)Oligo，選擇File→open，打開(kāi)要進(jìn)行引物分析的序列。PCR引物設(shè)計(jì)原理圖中顯示的三個(gè)指標(biāo)：Tm值、ΔG和Frequencies。退火溫度窗口是設(shè)計(jì)引物的主窗口，其他兩個(gè)具有輔助作用。PCR引物設(shè)計(jì)原理因?yàn)榉治鲆婕岸鄠€(gè)指標(biāo)，啟動(dòng)窗口的Cascade排列方式不太方便，可從windows菜單改為T(mén)ile方式。PCR引物設(shè)計(jì)原理用Tile方式顯示窗口PCR引物設(shè)計(jì)原理Tm，退火溫度窗口Tm值曲線以選取72℃附近為佳；5’到3’端的下降性狀也有利于引物引發(fā)聚合反應(yīng)。圈出來(lái)的序列部分及黃色的bar即代表當(dāng)前分析的21個(gè)堿基的Tm值可點(diǎn)擊窗口的左下角的Upper、Lower按鈕選擇上游引物、下游引物。PCR引物設(shè)計(jì)原理Tm值似乎太低了Tm值似乎太高了PCR引物設(shè)計(jì)原理顯示了裝載的整個(gè)序列的6-7mers寡核苷酸順序的相對(duì)頻率。寡核苷酸的3'端如果在一個(gè)特定的數(shù)據(jù)庫(kù)（GenBank的子數(shù)據(jù)庫(kù)）更普遍（即出現(xiàn)的頻率更高），那么更容易導(dǎo)致錯(cuò)誤引發(fā)。

Frequencies，堿基頻率窗口如果選擇出現(xiàn)頻率較低的位點(diǎn)作為3'末端，那么就減少了在復(fù)雜的底物（比如整個(gè)基因組DNA）內(nèi)的許多位點(diǎn)結(jié)合、引發(fā)的幾率，從而減少了非特異性PCR產(chǎn)物的形成。

PCR引物設(shè)計(jì)原理平均頻率為1000的話，CTTGGC的頻率為1500以上，而TTGGCG德頻率很低，約300。PCR引物設(shè)計(jì)原理ΔG，序列內(nèi)部堿基穩(wěn)定性窗口顯示了寡核苷酸的內(nèi)部穩(wěn)定性(五聚體的自有能)。-1.9值=-（3.1+3.1+3.1+1.6）ΔG值反應(yīng)了序列與模板的結(jié)合強(qiáng)度；最好引物的ΔG值在5’端和中間值比較高，而在3’端相對(duì)低。PCR引物設(shè)計(jì)原理在一個(gè)雙鏈結(jié)構(gòu)中，堿基對(duì)的相對(duì)穩(wěn)定性是由其鄰近堿基決定的，以自由能ΔG表示。dAdCdGdTdA-1.9-1.3-1.6-1.5dC-1.9-3.1-3.6-1.6dG-1.6-3.1-3.1-1.3dT-1.0-1.6-1.9-1.9第二個(gè)核苷酸第一個(gè)（5’）核苷酸例子：雙鏈d（ACGG/CCGT）的ΔG是：ΔG（ACGG）=ΔG（AC）+ΔG（CG）+ΔG（GG）=-（1.3+3.6+3.1）=-8.0kcol/molPCR引物設(shè)計(jì)原理顯示了3’末端序列ΔG值較低，適合引發(fā)。3’末端序列ΔG太高。PCR引物設(shè)計(jì)原理你可以在三個(gè)窗口中自行設(shè)計(jì)引物。選擇了自己認(rèn)為順眼的位置，此時(shí)，點(diǎn)擊Uper，上游引物即可顯示。同時(shí)在序列下游尋找下游引物，點(diǎn)擊Lower，即可顯示下游引物。對(duì)你設(shè)計(jì)的引物質(zhì)量進(jìn)一步分析。PCR引物設(shè)計(jì)原理同時(shí)在序列下游尋找下游引物，點(diǎn)擊Lower，即可顯示下游引物。PCR引物設(shè)計(jì)原理參數(shù)設(shè)置與搜索選擇search→forprimersandprobes，進(jìn)行如右圖設(shè)置。點(diǎn)擊searchranges，設(shè)置引物范圍和PCR產(chǎn)物的大小點(diǎn)擊parameters，進(jìn)行參數(shù)設(shè)置。因?yàn)樵O(shè)計(jì)的是一對(duì)引物，正、負(fù)鏈的復(fù)選框都要選上。同時(shí)選compatiblepairs默認(rèn)下，對(duì)引物的要求：無(wú)二聚體、3’高度特異、GC%含量有限定、去除錯(cuò)誤引發(fā)引物等。PCR引物設(shè)計(jì)原理引物的長(zhǎng)度及產(chǎn)物的長(zhǎng)度設(shè)置。PrimerLength設(shè)置在18－30bp,短了特異性不好，長(zhǎng)了沒(méi)有必要;PCRProductsize最好是100－500bp之間，小于100bp的PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳出來(lái)，條帶很模糊。上限沒(méi)有太多的限定。PCR引物設(shè)計(jì)原理普通設(shè)置、參數(shù)及更多參數(shù)從高到低六個(gè)等級(jí)的設(shè)定，最后有一個(gè)用戶定制選項(xiàng)。當(dāng)對(duì)軟件功能不了解時(shí)，應(yīng)選veryhigh/High。選automaticallychangestring后，搜索引物時(shí)，如果在高等級(jí)設(shè)定中無(wú)法搜索到引物對(duì)時(shí)自動(dòng)降級(jí)一個(gè)等級(jí)來(lái)搜索，直到找到為止。反向引物時(shí)用PCR引物設(shè)計(jì)原理讓引物的長(zhǎng)度可以改變，以適應(yīng)設(shè)定的Tm值或PE（primeEfficeince）值（引發(fā)效率）?？梢韵薅ㄋx引物對(duì)的最大數(shù)目。PCR引物設(shè)計(jì)原理實(shí)際上需要我們改動(dòng)的只有引物的長(zhǎng)度，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求做相應(yīng)改動(dòng)。其他的參數(shù)就使用Oligo默認(rèn)值，一般無(wú)需改動(dòng)。PCR引物設(shè)計(jì)原理直接使用Oligo默認(rèn)值，一般也無(wú)需改變。PCR引物設(shè)計(jì)原理參數(shù)設(shè)置完畢后，點(diǎn)擊確認(rèn)OK，程序即進(jìn)行引物搜索。PCR引物設(shè)計(jì)原理引物搜索結(jié)果如入：Oligo提供了按引物位置、產(chǎn)物大小、退火溫度、GC含量等的排列方式。PCR引物設(shè)計(jì)原理Oligo最突出的功能不在于引物搜索而在于引物分析。它提供了多種分析方法并以不同的形式展現(xiàn)出來(lái)。選擇其中的一對(duì)引物，這時(shí)程序自動(dòng)彈出一個(gè)PCR分析窗口。PCR引物設(shè)計(jì)原理PCRoptimalannealingtemperature

（最佳退火溫度）數(shù)值得參考。在PCR摸索條件的時(shí)候，退火溫度為其數(shù)值加減2的范圍就可以了。產(chǎn)物Tm值與引物Tm值（低的那個(gè)）的差異，一般控制在20度以內(nèi)。引物間Tm值的差異，一般控制在5-6度以內(nèi)。引發(fā)效率：上（下）引物對(duì)于正、負(fù)鏈正確引發(fā)效率比。最佳引物濃度PCR引物設(shè)計(jì)原理在Analyze菜單中，Oligo提供了眾多分析功能。選擇相應(yīng)的功能，分析結(jié)果。PCR引物設(shè)計(jì)原理點(diǎn)擊Selectedprimers，會(huì)給出兩條引物的概括性信息;其中包括引物的Tm值，此值Oligo是采用nearestneighbormethod計(jì)算，會(huì)比Primer5中引物的Tm值略高;引物的DeltaG和3’端的DeltaG:3’端的DeltaG過(guò)高，會(huì)在錯(cuò)配位點(diǎn)形成雙鏈結(jié)構(gòu)并引起DNA聚合反應(yīng)，因此此項(xiàng)絕對(duì)值應(yīng)該小一些，最好不要超過(guò)9。KeyInfoPCR引物設(shè)計(jì)原理Duplexformation，引物二聚體引物二聚體是影響PCR反應(yīng)異常的重要因素→應(yīng)避免，至少也要使設(shè)計(jì)的引物形成的二聚體是不穩(wěn)定的，即其ΔG值應(yīng)該偏低→由退火溫度決定，50°的退火溫度和65°對(duì)二聚體的影響肯定不一樣。Themoststable3’-Dimer

DeltaG絕對(duì)值一般不要超過(guò)4.5kcal/mol。△G絕對(duì)值越大結(jié)構(gòu)越穩(wěn)定。結(jié)合堿基對(duì)不要超過(guò)3個(gè)。themoststableDimeroverall絕對(duì)值一般應(yīng)小于多少kcal/mol跟PCR退火溫度有關(guān)。實(shí)驗(yàn)表明在PCR退火溫度65°時(shí)，6.7kcal/mol沒(méi)有問(wèn)題。PCR引物設(shè)計(jì)原理Hairpinformation，引物發(fā)夾結(jié)構(gòu)DeltaG絕對(duì)值一般不要超過(guò)4.5kcal/mol。結(jié)合堿基對(duì)不要超過(guò)3個(gè)。特定的發(fā)夾如果沒(méi)有顯示Tm值，那么發(fā)夾結(jié)構(gòu)就不容易形成。PCR引物設(shè)計(jì)原理結(jié)合堿基對(duì)已經(jīng)超過(guò)3個(gè)。PCR引物設(shè)計(jì)原理在3’形成發(fā)夾會(huì)引發(fā)引物內(nèi)部的延伸反應(yīng)，減少了參加正式反應(yīng)引物的數(shù)量。PCR引物設(shè)計(jì)原理CompositionandTm上下游引物的GC％控制在40％～60％。最后一種是Primer5所采用的方法。TdisanormalizedTmin1MsaltconditionstheTmisavariablevalue,thatdependsonsaltandDNAconcentrationsetintheSearchParameterswindowTm值高時(shí)錯(cuò)配很少，特異性強(qiáng)。PCR引物設(shè)計(jì)原理Falseprimingsites，錯(cuò)誤引發(fā)位點(diǎn)oligo會(huì)給正確引發(fā)效率和錯(cuò)誤引發(fā)效率。一般的原則：使誤引發(fā)效率控制在100以下。有時(shí)候正確位點(diǎn)的引發(fā)效率很高的話，比如達(dá)到400～500，錯(cuò)誤引發(fā)效率超過(guò)100幅度若不大的話，也可以接受。Primer的primingefficiency應(yīng)該是錯(cuò)配地方的4倍左右，更多當(dāng)然更好。PCR引物設(shè)計(jì)原理下游引物對(duì)于負(fù)鏈，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)錯(cuò)誤引發(fā)。PCR引物設(shè)計(jì)原理SelectedOligoPCR引物設(shè)計(jì)原理Primerpairs系統(tǒng)設(shè)計(jì)出的所有引物對(duì)。PCR引物設(shè)計(jì)原理internalstabilityInternalstability很重要：我們希望引物的內(nèi)部穩(wěn)定性是中間高、兩邊低的弧形，最起碼保證3端不要過(guò)于穩(wěn)定。引物3端過(guò)于穩(wěn)定，很容易導(dǎo)致不適當(dāng)擴(kuò)增。PCR引物設(shè)計(jì)原理上游引物的參數(shù)注意：必需把方框拉到上游引物處。PCR引物設(shè)計(jì)原理對(duì)應(yīng)的下游引物的參數(shù)注意：必需把方框拉到下游引物處。PCR引物設(shè)計(jì)原理Hybridizationtime，雜交時(shí)間該窗口顯示了不同長(zhǎng)度、不同濃度的寡核苷酸的雜交時(shí)間

PCR引物設(shè)計(jì)原理Concentration您只需點(diǎn)一下鼠標(biāo)，就輕松地實(shí)現(xiàn)對(duì)你地引物、PCR產(chǎn)物、DNA模版鏈即時(shí)的濃度、體積、OD值、分子量的轉(zhuǎn)換。該濃度窗口是一個(gè)強(qiáng)大的時(shí)間保存計(jì)算器。PCR引物設(shè)計(jì)原理Oligo不僅能以圖表的方式將結(jié)果展示出來(lái)，還能以文本的形式保存。在軟件所出現(xiàn)的任何一個(gè)窗口，選擇As，把數(shù)據(jù)存為一個(gè)文本文件。PCR引物設(shè)計(jì)原理文本保存的結(jié)果如下：最佳退火溫度最佳引物濃度、鹽濃度PCR引物設(shè)計(jì)原理Primerpremier5設(shè)計(jì)引物→Oligo引物評(píng)估

舉例說(shuō)明：ncbi里查找基因LIF的mRNA序列，用FASTA格式直接保存改基因的CDS區(qū)序列。PCR引物設(shè)計(jì)原理上游引物PCR引物設(shè)計(jì)原理下游引物PCR引物設(shè)計(jì)原理可以看出，Oligo對(duì)引物進(jìn)行了非常全面的分析，為選擇最佳的引物提供了參考。Oligo不僅能對(duì)所搜索的引物進(jìn)行全面分析，還能對(duì)任意的寡核苷酸進(jìn)行分析。選擇se