抗菌佐劑的制備及免疫效果評(píng)價(jià)

壞死性細(xì)菌疾病一直是影響畜牧業(yè)發(fā)展的主要疾病。近年來，畜牧業(yè)業(yè)希望通過疫苗預(yù)防和控制對(duì)鹿的損害。迄今國(guó)內(nèi)尚無壞死桿菌病免疫成功的報(bào)道。本文在病原分離鑒定、血清學(xué)診斷、毒力菌株動(dòng)物感染試驗(yàn)和用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物兔進(jìn)行免疫原篩選等前期研究基礎(chǔ)上,開展了對(duì)本動(dòng)物鹿的免疫原性試驗(yàn),以探討毒力菌株FN(AB)94免疫原接種鹿后,是否能刺激鹿產(chǎn)生抗同源壞死梭桿菌的有效抵抗力,從而為研制鹿壞死桿菌病的疫苗提供可靠的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。1材料和方法1.1蘑菇壞死梭桿菌毒力菌株FN(AB)94為本室篩選保存的鹿源壞死梭桿菌AB型毒力菌株。1.2acintific公司培養(yǎng)設(shè)備為厭氧手套箱(美國(guó)FormaScientific公司產(chǎn)品)。厭氧培養(yǎng)基包括血液瓊脂培養(yǎng)基和Eugonbroth液體增菌培養(yǎng)基。1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物7頭健康鹿,2～6歲,由中國(guó)農(nóng)科院茸鹿實(shí)驗(yàn)基地提供;實(shí)驗(yàn)鹿隨機(jī)分為2組,一組4頭為免疫試驗(yàn)組,一組3頭為感染對(duì)照組。1.4血清比較陽(yáng)性血清為壞死梭桿菌毒力菌株FN(AB)94接種試驗(yàn)兔獲得的抗壞死梭桿菌抗血清;陰性血清為健康鹿血清。1.5尊敬的服務(wù)福氏完全佐劑為Gibco公司產(chǎn)品。1.6保定活性物質(zhì)眠乃靈和蘇醒靈購(gòu)于解放軍軍需大學(xué),為試驗(yàn)鹿免疫、攻毒和采血等麻醉用藥。1.7fnab94抗劑的抗劑壞死梭桿菌毒力菌株FN(AB)94在厭氧培養(yǎng)基上培養(yǎng)18～24小時(shí),離心收集菌體,裂解后加入等量佐劑,研磨乳化,制備成乳化佐劑疫苗。1.8疫苗接種方法將乳化好的免疫原分別接種4頭鹿,每頭鹿接種4ml,耳后根頸部皮下注射,接種前頸靜脈采血。1.9養(yǎng)鹿期菌液防感染處理壞死梭桿菌毒力菌株FN(AB)94在厭氧培養(yǎng)基上培養(yǎng)24小時(shí),培養(yǎng)菌液配制成3.2×109個(gè)菌/ml;將不同感染量菌液分別經(jīng)耳后根頸部皮下接種于4頭免疫鹿和3頭對(duì)照鹿。攻毒前采血?；烊猴曫B(yǎng)觀察感染變化。1.10血清抗體檢測(cè)方法對(duì)流免疫電泳方法檢測(cè),免疫鹿感染毒力菌株FN(AB)94后,間隔2個(gè)月采血一次,持續(xù)到8個(gè)月。2結(jié)果2.1抗體水平消長(zhǎng)情況4頭健康鹿(133、185、259和940號(hào))分別接種疫苗后,間隔一定時(shí)間頸靜脈采血,進(jìn)行對(duì)流免疫電泳檢測(cè),觀察免疫后鹿體內(nèi)抗體水平的消長(zhǎng)情況。結(jié)果表明,4頭健康鹿接種疫苗20天后,可在血清中檢測(cè)出抗壞死梭桿菌抗體,跟蹤檢測(cè)于免疫30、130、180天后,免疫鹿133、185、259和940號(hào)都能檢到相應(yīng)抗體。免疫7個(gè)月后,發(fā)現(xiàn)185號(hào)、259號(hào)和940免疫鹿血清中仍有抗體存在。說明用壞死梭桿菌毒力菌株FN(AB)94免疫原研制的疫苗具有良好的抗原性,可刺激免疫鹿產(chǎn)生抗體維持6個(gè)月以上。2.2免疫鹿fnab的臨床感染癥狀4頭鹿接種疫苗30天后,于頸靜脈分別接種同源壞死梭桿菌FN(AB)94毒力菌株培養(yǎng)物,185、259號(hào)鹿分別接種150億菌/頭,133、940號(hào)鹿分別接種400億菌/頭,3頭對(duì)照鹿分別接種150、250、350億菌的菌液(表1),與免疫鹿混群飼養(yǎng),逐日觀察試驗(yàn)鹿的情況。結(jié)果表明,免疫鹿接種壞死梭桿菌FN(AB)94毒力菌株后,4頭試驗(yàn)鹿在6個(gè)月內(nèi)不表現(xiàn)任何臨床感染癥狀,狀態(tài)良好。近7個(gè)月時(shí),除133號(hào)鹿頸部出現(xiàn)1～2個(gè)小膿包外,185、259和940號(hào)免疫鹿均表現(xiàn)臨床健康。2頭對(duì)照鹿接種壞死梭桿菌FN(AB)94毒力菌株后,分別于120天開始表現(xiàn)典型感染癥狀,于150天臨床癥狀明顯,頸部出現(xiàn)多個(gè)化膿性膿包,核桃大到拳頭大。試驗(yàn)初步證明壞死梭桿菌毒力菌株FN(AB)94免疫原具有良好的免疫原性。3免疫鹿的免疫效果長(zhǎng)期以來,人們一直把壞死桿菌病列為無法進(jìn)行免疫預(yù)防的疾病,甚至對(duì)研制壞死桿菌病設(shè)苗不抱任何希望。由于分離培養(yǎng)壞死梭桿菌需要特殊的分離條件和培養(yǎng)要求,因此國(guó)內(nèi)、外對(duì)壞死桿菌病的研究較少。綜觀國(guó)外某些學(xué)者對(duì)壞死桿菌病的免疫研究,發(fā)現(xiàn)他們進(jìn)行免疫試驗(yàn)一些不成功的原因在于:一是用于從事壞死梭桿菌免疫原性探討,沒有建立確切的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物感染模型;二是所用的試驗(yàn)菌株局限于幾個(gè)菌株,而許多試驗(yàn)已經(jīng)證明所用的試驗(yàn)菌株免疫原性差。我們大量試驗(yàn)證明,對(duì)壞死梭桿菌分離菌株的反復(fù)篩選是發(fā)現(xiàn)具有免疫原性菌株的關(guān)鍵。在前期試驗(yàn)中,我們篩選出壞死梭桿菌毒力菌株FN(AB)94免疫原,用該免疫原研制疫苗接種實(shí)驗(yàn)兔進(jìn)行了攻毒試驗(yàn),結(jié)果疫苗可以抵抗2個(gè)MLD的感染,疫苗免疫期達(dá)到6個(gè)月以上。在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物上初步證明了壞死梭桿菌毒力菌株研制的疫苗具有良好的免疫原性。為進(jìn)一步確定所研制疫苗的免疫效果,必需進(jìn)行本動(dòng)物鹿的疫苗攻毒試驗(yàn)。通過本試驗(yàn)觀察到,疫苗免疫鹿,免疫鹿血清中抗壞死桿菌病抗體的維持時(shí)間較長(zhǎng),個(gè)月后仍能檢測(cè)到抗體的存在。疫苗免疫鹿1個(gè)月后,用同源毒力菌株進(jìn)行攻毒試驗(yàn),在對(duì)照鹿都呈現(xiàn)發(fā)病狀態(tài)情況下,所有免疫鹿在6個(gè)