雷公藤多苷誘導(dǎo)小鼠睪丸生殖相關(guān)基因表達(dá)及補(bǔ)腎中藥的干預(yù)作用

雷公藤最初被收集在《神農(nóng)本草經(jīng)》中。具有驅(qū)風(fēng)除濕、活血通絡(luò)、消腫脹止痛、殺蟲解毒等功效。雷公藤多苷是雷公藤根莖提取物,目前作為有效藥物被廣泛應(yīng)用于慢性腎炎、糖尿病腎病等治療。上世紀(jì)80年代有學(xué)者報(bào)道患者服用雷公藤后可出現(xiàn)死精子癥或少精子癥,提示其有抗生育活性?！澳I主生殖”理論是中醫(yī)臟象學(xué)說對人體生殖功能、生理病理的基本認(rèn)識。腎藏精是腎主生殖的基礎(chǔ)。先天之精(即生殖之精)是形成人體的原始物質(zhì),是人體生命活動(dòng)的根據(jù)。腎精化生陰陽,陰陽互生互根。腎所藏的生殖之精與現(xiàn)代所認(rèn)識的遺傳物質(zhì)頗為相似。大量臨床實(shí)踐表明補(bǔ)腎中藥能夠調(diào)節(jié)生殖功能。我們通過雷公藤生殖減退模型小鼠研究生殖相關(guān)基因改變及中藥補(bǔ)益腎陽藥物肉蓯蓉、補(bǔ)益腎陰藥物熟地及陰陽雙補(bǔ)和肉蓯蓉預(yù)防用藥的干預(yù)作用。1材料和方法1.1實(shí)驗(yàn)材料1.1.1美國普通四方社學(xué)動(dòng)物開發(fā)使用成年Balb/C雄性小鼠104只,體重25g左右。由上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號:SYXK(滬)2004-0005;實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號0058668。分籠飼養(yǎng)于12h光照、45%左右相對濕度的飼養(yǎng)籠中,自由飲食。1.1.2測試試劑SSIII逆轉(zhuǎn)錄酶購自Invitrogen公司;定量PCR試劑盒(SYBRGreen)購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1模型的建立和處理實(shí)驗(yàn)室條件下Balb/C小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周,隨機(jī)分為正常組22只,造模組70只,肉蓯蓉預(yù)處理組12只。造模組給予雷公藤多甙30mg/(kg·d)灌胃[按照成人1.5mg/(kg·d)的20倍計(jì)算];肉蓯蓉預(yù)處理組同時(shí)給予雷公藤多甙30mg/(kg·d)和肉蓯蓉煎液按照相當(dāng)于生藥10g/(kg·d)的劑量灌胃;正常組給予生理鹽水灌胃。3周后造模組和正常組各隨機(jī)抽取10只觀察精子狀況,與雌鼠合籠1周,觀察雌鼠懷孕率,以與正常組比較出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)為模型成功。將造模組隨機(jī)分為模型組、雷公藤組、肉蓯蓉組、熟地組和熟地蓯蓉組各12只。模型組:給予生理鹽水0.25ml,每日1次灌胃,本組在灌胃4周時(shí)死亡1只,代謝籠收集尿液時(shí)死亡1只。雷公藤組:雷公藤多甙30mg/(kg·d)0.25ml,每日1次灌胃。肉蓯蓉組:肉蓯蓉煎液相當(dāng)于生藥10g/(kg·d)[按照成人0.5g/(kg·d)的20倍計(jì)算]0.25ml,每日1次灌胃,本組在代謝籠收集尿液時(shí)死亡1只。熟地組:熟地煎液相當(dāng)于生藥10g/(kg·d)[按照成人0.5g/(kg·d)的20倍計(jì)算]0.25ml,每日1次灌胃,本組在代謝籠收集尿液時(shí)死亡1只。熟地蓯蓉組:肉蓯蓉、熟地等比例的煎液相當(dāng)于生藥20g/(kg·d)[按照成人1g/(kg·d)的20倍計(jì)算]0.25ml,每日1次灌胃,本組在代謝籠收集尿液時(shí)死亡1只。按照上面方法繼續(xù)灌胃3周,合籠1周后,雄鼠取睪丸組織置于液氮后-80℃冰箱中冷凍保存。1.2.2觀察指標(biāo)和測試方法1.2.2.小鼠精子懸浮液的制備頸椎脫臼法處死小鼠,分離附睪,分別置于盛有1ml9.0g/L生理鹽水的培養(yǎng)皿中,將附睪尾剪成小塊,用吸管將懸浮液輕輕吹打5~6次,靜置3~5min,在懸液中加入1%伊紅溶液80μl混勻染色15~20min后,取1滴置于清潔的玻片上,均勻推片,鏡檢。每只小鼠觀察300個(gè)精子。精子畸變類型包括無鉤、香蕉形、無定形、胖頭、雙頭、雙尾、尾折疊等。1.2.2.2只大鼠的懷孕率雌鼠與雄鼠合籠后,雌鼠繼續(xù)正常飼養(yǎng)2周,觀察幼鼠及胎鼠數(shù),計(jì)算懷孕率。1.2.2.實(shí)時(shí)熒光探針檢測相關(guān)基因的表達(dá)冰凍睪丸組織碾磨及勻漿后,常規(guī)氯仿法抽提組織總RNA,-80℃保存。取RNA5μg置于一已滅菌的Eppendorf管內(nèi),依次加入Oligo(dT)12-18(500μg/ml)1μl,隨機(jī)引物(500μg/ml)1μl,10mmol/LdNTPs1μl,加雙蒸水至12μl,振蕩混勻,置于65℃水浴5min。取出后,迅速置于冰上;短暫離心后,分別加入5×第一鏈緩沖液4μl,0.1mol/LDTT2μl,RNase抑制劑1μl,溫和混勻,將Eppendorf管置于42℃水浴2min;加入1μl逆轉(zhuǎn)錄酶,混合均勻,將Eppendorf管置于52℃水浴50min;隨后置于70℃水浴15min以終止反應(yīng)。將反轉(zhuǎn)錄所得cDNA稀釋5倍,使其濃度為50ng/μl。使用RealtimePCRMasterMix(SYBRGreen)試劑盒在ABIPCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行生殖相關(guān)基因擴(kuò)增,采用優(yōu)化的反應(yīng)條件以β-肌動(dòng)蛋白為管家基因進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng),考察隨模板濃度變化擴(kuò)增曲線的起峰情況,確定模板的使用濃度,建立5μl反應(yīng)體系,包括2×Mix2.5μl,cDNA模板0.5μl,特異熒光探針引物(包括Dzip1、Fas、c-jun、Wnt4基因,由Invitrogen公司合成)各0.5μl。具體反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性10s;95℃變性15s,60℃退火15s,72℃延伸15s,共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本同時(shí)設(shè)立3個(gè)平行管,每次反應(yīng)均設(shè)置熔解曲線分析,以證實(shí)無非特異性擴(kuò)增。反應(yīng)完成后系統(tǒng)軟件自動(dòng)給出每個(gè)樣本擴(kuò)增的Ct值,根據(jù)目的基因Dzip1、Fas、c-jun、Wnt4和管家基因β-肌動(dòng)蛋白的Ct值,計(jì)算出目的基因的相對表達(dá)量,以2-△△Ct表示。1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。根據(jù)初計(jì)算,直接描述了利用數(shù)據(jù)保理,計(jì)量資料把反思說,又稱“計(jì)采用SPSS16.0軟件包分析和處理數(shù)據(jù),計(jì)量資料用表示。兩組樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn),率的比較采用χ2檢驗(yàn),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1小鼠精子畸形試驗(yàn)雷公藤模型小鼠附睪中精子濃度和活動(dòng)力大大減少,畸形精子增多,主要表現(xiàn)為頭尾分離和頂體彎曲?；兙颖憩F(xiàn)為無鉤、香蕉形、無定形、胖頭、雙頭、頭頸斷裂、頸部斷端高度卷曲、尾部膨大、雙尾和尾折疊等。小鼠灌服雷公藤3周(造模組)和6周(雷公藤組)后精子畸形率見表1。造模組(雷公藤3周)與正常對照組(3周)比較,精子畸形率顯著上升(P<0.05);雷公藤組(雷公藤6周)與正常對照組(6周)比較,精子畸形率進(jìn)一步上升(P<0.01),說明雷公藤的生殖毒性有時(shí)間依賴性。2.2組大鼠妊娠率結(jié)果比較前期研究發(fā)現(xiàn),通過給雄鼠不同劑量的雷公藤多苷,觀察不同時(shí)間點(diǎn)與各組雄鼠交配的雌鼠的懷孕率,發(fā)現(xiàn)雌鼠懷孕率隨雄鼠服用雷公藤多苷時(shí)間延長和劑量增加呈下降趨勢。本次實(shí)驗(yàn)雷公藤灌服3周造模組與正常組交配雌鼠懷孕率比較有顯著差異(P<0.05),見表2。造模后分組干預(yù),模型組與正常組交配雌鼠懷孕率仍然顯示出顯著差異(P<0.05);肉蓯蓉組、熟地組和熟地蓯蓉組與模型組比較無明顯差異(P>0.05),與雷公藤組和肉蓯蓉預(yù)處理組比較亦沒有顯著差異(P>0.05),見表3。2.3相關(guān)基因的突變2.3.1不同模型組生殖相關(guān)基因表達(dá)情況實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果(圖1)顯示,經(jīng)雷公藤多甙灌胃的模型組(雷公藤灌胃3周)和雷公藤組(雷公藤灌胃6周),生殖相關(guān)基因Fas、c-jun、Wnt4和Dzip1較正常組有明顯的差異,見表4。與正常組相比,模型組上調(diào)1.5倍以上的生殖相關(guān)基因有Fas、c-jun、Wnt4,在雷公藤組進(jìn)一步上調(diào);與正常組相比,模型組下調(diào)0.75倍以下的生殖相關(guān)基因?yàn)镈zip1,在雷公藤組進(jìn)一步下調(diào)。2.3.2不同處理的生殖相關(guān)基因檢測經(jīng)過補(bǔ)腎中藥肉蓯蓉、熟地干預(yù),生殖相關(guān)基因Fas、c-jun、Wnt4和Dzip1的表達(dá)得到相應(yīng)的調(diào)節(jié),見表5。與模型組相比,雷公藤組進(jìn)一步改變達(dá)到顯著意義(上調(diào)1.5倍以上或者下調(diào)0.75倍以下)的生殖相關(guān)基因有Fas、Wnt4;肉蓯蓉組下調(diào)Fas、Wnt4,上調(diào)Dzip1,均達(dá)到顯著意義;熟地組下調(diào)c-jun、Wnt4達(dá)到顯著意義;熟地蓯蓉聯(lián)合組下調(diào)Fas、c-jun達(dá)到0.75倍以下,下調(diào)Wnt4達(dá)到0.5倍以下,較單用肉蓯蓉組和單用熟地組顯示出更大的優(yōu)勢。2.3.3fas的降低雷公藤持續(xù)灌胃小鼠經(jīng)肉蓯蓉預(yù)處理,生殖相關(guān)基因Fas得到顯著下調(diào),見表6。與雷公藤組相比,肉蓯蓉預(yù)處理組下調(diào)Fas達(dá)到顯著意義改變,提示肉蓯蓉拮抗雷公藤生殖毒性,有一定的預(yù)防作用。3雷公藤對小鼠睪丸生殖相關(guān)基因的表達(dá)雷公藤為衛(wèi)矛科植物,其藥用部位多用去二層皮的根木質(zhì)部。雷公藤中已分離出70多種化學(xué)單體,其中以二萜內(nèi)酯為主要的活性成分,雷公藤多甙由其提煉精制而成,具有抗炎、抑制免疫等作用,臨床應(yīng)用前景廣闊,但其生殖毒性一定程度上限制了雷公藤制劑的發(fā)展。筆者從腎主生殖的理論出發(fā),用雷公藤多甙制備模型小鼠,從生殖相關(guān)基因的角度進(jìn)行研究。本研究發(fā)現(xiàn),雷公藤模型小鼠出現(xiàn)毛發(fā)枯槁、無光澤或豎毛,以后逐漸加重,出現(xiàn)弓背蜷縮,行動(dòng)遲緩,嗜睡、倦怠懶動(dòng)等一系列癥狀。雷公藤模型小鼠精子畸形率較正常組顯著增加,并呈現(xiàn)時(shí)間依賴性;模型組小鼠懷孕率較正常組顯著降低。進(jìn)入21世紀(jì)基因時(shí)代,人類已經(jīng)發(fā)現(xiàn)許多與生殖相關(guān)的重要基因,通過GO聚類分析有600多個(gè)生殖相關(guān)基因。新鑒定的基因Dzip1編碼與DAZ(deletedinazoospermia)相互作用的蛋白,在胚胎干細(xì)胞和生殖細(xì)胞中表達(dá)。DAZ基因編碼的睪丸特異性RNA結(jié)合蛋白特異表達(dá)在精原細(xì)胞和減數(shù)分裂早期的生精細(xì)胞,參與生精功能轉(zhuǎn)錄子的翻譯調(diào)控,是激活精子生成和保持Y染色體功能的重要基因。Wnt4基因(Wingless-relatedMMTVintegrationsite4)是Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)家族中的一員,表達(dá)于未分化性腺。Wnt4可以抑制雄性性分化,Wnt4以一種劑量敏感的方式阻止睪丸的形成。Fas基因位于10號染色體長臂10q24.1,主要在精母細(xì)胞和精子細(xì)胞中表達(dá),參與生精細(xì)胞凋亡。在精子生成過程中,通過Fas/FasL旁分泌途徑調(diào)控生殖細(xì)胞的增殖、分化和精子的產(chǎn)量,穩(wěn)定生殖細(xì)胞數(shù)量。c-jun基因是即刻早期基因(immediatelyearlygenes,IEGs)jun家族成員之一,其表達(dá)產(chǎn)物在多種基因表達(dá)、細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、凋亡等過程中起重要作用。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)精原細(xì)胞表達(dá)c-jun,調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄活性,從而影響精原細(xì)胞的分裂。我們在前期基因芯片檢測的基礎(chǔ)上篩選出31個(gè)生殖相關(guān)基因在雷公藤模型中有較顯著改變,通過本次研究實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)雷公藤模型小鼠睪丸生殖相關(guān)基因中Y染色體微缺失相關(guān)基因———Dzip1基因下調(diào);信號轉(zhuǎn)導(dǎo)家族Wnt4基因上調(diào);生殖細(xì)胞凋亡相關(guān)基因———Fas基因上調(diào);原癌基因———c-jun基因表達(dá)上調(diào)。這些基因的表達(dá)異常,對生殖細(xì)胞的生理功能產(chǎn)生很大的影響。中醫(yī)“腎主生殖”理論與現(xiàn)代遺傳學(xué)相契合。我們通過補(bǔ)益腎陽藥物肉蓯蓉、補(bǔ)益腎陰藥物熟地及肉蓯蓉與熟地聯(lián)合應(yīng)用進(jìn)行干預(yù),結(jié)果顯示雷公藤模型小鼠Dzip1基因經(jīng)肉蓯蓉干預(yù)后有顯著上調(diào);Wnt4基因經(jīng)肉蓯蓉、熟地干預(yù)后顯著下調(diào),肉蓯蓉與熟地聯(lián)合應(yīng)用起到協(xié)同作用;Fas基因在肉蓯蓉、肉蓯蓉與熟地聯(lián)合應(yīng)用組均表現(xiàn)出下調(diào)作用;cjun基因在熟地組、肉蓯蓉與熟地聯(lián)合應(yīng)用組表現(xiàn)出下調(diào)作用。提示補(bǔ)腎藥物具有拮抗雷公藤生殖毒性作用,補(bǔ)益腎陽與補(bǔ)益腎陰聯(lián)合應(yīng)用優(yōu)于單用補(bǔ)益腎陽藥物,單用補(bǔ)益腎陰藥物作用較前兩者均次。體現(xiàn)了中醫(yī)陰陽互根互生理論,正如明代儒醫(yī)張景岳所論述“善補(bǔ)陽者必于陰中求陽,則陽得陰助而生化無窮”。我們在研究補(bǔ)腎中藥對雷公藤模型小鼠的干預(yù)作用的同時(shí),設(shè)立了一組肉蓯蓉預(yù)處理組,在用雷公藤處理的