脂質(zhì)體介導(dǎo)的內(nèi)皮抑素基因轉(zhuǎn)移抑制小鼠視網(wǎng)膜新生血管的研究

各種視網(wǎng)膜疾病與新血管有關(guān)，如糖尿病性視網(wǎng)膜病變、視網(wǎng)膜血管阻塞和早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變。阻止新生血管生長(zhǎng)是治療此類疾病的關(guān)鍵。內(nèi)皮抑素(endostatin,ES)是一種內(nèi)源性新生血管抑制因子,可以特異性抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖從而抑制新生血管的生長(zhǎng)?？寺SDNA得到的重組ES蛋白半衰期短,而視網(wǎng)膜新生血管生長(zhǎng)是一較長(zhǎng)期的過(guò)程,只有持續(xù)性用藥,才能在組織中維持穩(wěn)定、有效藥物濃度。將ES基因轉(zhuǎn)入視網(wǎng)膜靶組織內(nèi)使其持續(xù)分泌,達(dá)到有效濃度是一個(gè)較為理想的方法。本研究通過(guò)缺氧誘導(dǎo)的鼠視網(wǎng)膜新生血管動(dòng)物模型,觀察脂質(zhì)體介導(dǎo)的內(nèi)皮抑素基因轉(zhuǎn)移抑制視網(wǎng)膜新生血管的作用效果,探討ES基因轉(zhuǎn)移抑制視網(wǎng)膜新生血管的可行性。材料和方法一、小鼠視網(wǎng)膜新生血管模型根據(jù)文獻(xiàn)的方法建立小鼠缺氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜新生血管動(dòng)物模型,1周齡(生后7d,P7)C57Bl/6N小鼠與母鼠一起置于氧濃度為(75±2)%的氧箱中5d,在生后第12天(P12)回到正常環(huán)境中誘導(dǎo)視網(wǎng)膜新生血管模型。二、脂質(zhì)體pccda3-es混合物a,b的制備真核細(xì)胞表達(dá)載體PCDNA3-ES由山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院趙躍然教授提供,PCDNA3-ES重組質(zhì)粒采用堿裂解法制備并純化。將1μgPCDNA3-ES溶于5μl無(wú)血清培養(yǎng)液中稀釋,配成A液;3μg脂質(zhì)體(lipofectamineTM,美國(guó)Invitrogen公司)溶于5μl無(wú)血清培養(yǎng)液中稀釋,配成B液;輕柔混合A、B液,室溫下孵育30min,制成脂質(zhì)體PCDNA3-ES復(fù)合物。將1μg空白載體PCDNA3質(zhì)粒代替PCDNA3-ES配成A液,與B液混合,制備空白載體脂質(zhì)體復(fù)合物。三、試驗(yàn)組和玻璃腔注射小鼠出氧箱后(P12)采用如下分組行玻璃體腔注射。1.第一組ES基因轉(zhuǎn)移組28只,玻璃體腔注射脂質(zhì)體PCDNA3-ES復(fù)合物2μl。2.第2組載體對(duì)照組11只,玻璃體腔注射脂質(zhì)體PCDNA3復(fù)合物2μl。3.第三組空白對(duì)照組11只,玻璃體腔注射等量PBS。注射后5d,分別進(jìn)行視網(wǎng)膜鋪片、組織切片和免疫組化檢查。四、熒光素標(biāo)記右旋糖酐新生血管模型鼠ES轉(zhuǎn)移組12只,對(duì)照組6只,包括3只載體對(duì)照,3只陰性對(duì)照。小鼠麻醉下上腔靜脈注射1ml含25mg熒光素標(biāo)記的右旋糖酐(美國(guó)Sigma公司)。過(guò)量麻醉處死動(dòng)物,摘除眼球,4%多聚甲醛固定2h,顯微鏡下視網(wǎng)膜鋪片,熒光顯微鏡下觀察視網(wǎng)膜血管結(jié)構(gòu)。五、細(xì)胞數(shù)量的檢測(cè)新生血管模型鼠ES轉(zhuǎn)染組12只,對(duì)照組12只,包括6只載體對(duì)照,6只陰性對(duì)照。眼球摘除后固定、脫水、浸蠟包埋、6μm厚連續(xù)切片,每隔10張切片連續(xù)選取5張制備在1張玻片,從通過(guò)視乳頭的切片開(kāi)始選取。每個(gè)眼球選取10張玻片。過(guò)碘酸-雪夫染色,光鏡下觀察突破內(nèi)界膜的細(xì)胞數(shù)量。將總數(shù)除以50,計(jì)算出每眼每張切片的細(xì)胞數(shù)量。六、兩組患者常規(guī)免疫組化檢測(cè)新生血管模型鼠ES轉(zhuǎn)染組4只,對(duì)照組4只,包括2只載體對(duì)照,2只陰性對(duì)照。分別于注射后1d、3d、1周、2周眼球摘除,冷凍膠包埋,冷凍切片,常規(guī)免疫組化檢測(cè)。Ⅰ抗采用兔抗人ES單克隆抗體(美國(guó)AlphaDiagnostic公司),Ⅱ抗采用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG(武漢博士德公司),常規(guī)DAB染色,甲綠復(fù)染。七、載體載體的制備正常P12小鼠6只,分別取右眼進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。2只眼注射ES脂質(zhì)體復(fù)合物2μl,2只眼注射空白載體作為載體對(duì)照,2只眼注射2μlPBS作為陰性對(duì)照。注射后7d,眼球摘除,顯微鏡下剪除角膜和晶體,保留眼后段,置于盛有2.5%戊二醛的小瓶中4℃固定12h。經(jīng)清洗、后固定、脫水、浸透及包埋、切片、染色,JEM-1200EX(日本JEOL公司)投射電鏡觀察拍照并記錄。八、統(tǒng)計(jì)評(píng)估數(shù)據(jù)處理通過(guò)SPSS10.0軟件分析系統(tǒng)進(jìn)行計(jì)算,組間比較采用方差分析,組間兩兩比較采用其中的LSD檢驗(yàn)。結(jié)果一、大鼠視網(wǎng)膜新生血管及熒光素滲漏正常P12小鼠視網(wǎng)膜鋪片可見(jiàn)視乳頭周圍放射狀分布視網(wǎng)膜血管,血管分布規(guī)則,全視網(wǎng)膜毛細(xì)血管分為2層,呈網(wǎng)狀分布(圖1,2)?？瞻讓?duì)照組:新生血管模型鼠在氧箱中生活5d后,從視乳頭發(fā)出的血管數(shù)量減少,視乳頭周圍至中周部視網(wǎng)膜深層毛細(xì)血管廣泛閉鎖,大量無(wú)灌注區(qū),無(wú)灌注區(qū)邊緣均可見(jiàn)新生血管芽及熒光素滲漏(圖3),其中2只眼有視乳頭新生血管及熒光素滲漏。載體對(duì)照組:3只眼視網(wǎng)膜均可見(jiàn)大量新生血管芽及熒光素滲漏。ES注射組:12只眼視網(wǎng)膜均可見(jiàn)新生血管芽,但新生血管芽的數(shù)量明顯減少(圖4),未見(jiàn)視乳頭新生血管,也未見(jiàn)較明顯的熒光素滲漏。二、組患者關(guān)聯(lián)顯著性統(tǒng)計(jì)f:9.973,p新生血管模型鼠各組均可見(jiàn)突破內(nèi)界膜的內(nèi)皮細(xì)胞,有的形成血管索。第1組突破內(nèi)界膜的細(xì)胞數(shù)量平均為16.99個(gè),第2組為19.01個(gè),第3組為19.13個(gè),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=9.773,P=0.001)。兩兩比較,1組和2組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.002);1組和3組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001);2組和3組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.859)。三、視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層細(xì)胞陽(yáng)性染色注射后1d視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層可見(jiàn)棕色顆粒,位于細(xì)胞中,外核層可見(jiàn)甲綠染色。注射后3d可見(jiàn)染色顆粒增多,部分內(nèi)核層細(xì)胞也可見(jiàn)棕色陽(yáng)性顆粒(圖5)。載體對(duì)照及陰性對(duì)照未見(jiàn)染色(圖6)。注射后1周仍有染色未見(jiàn)數(shù)量減少。注射后2周仍可見(jiàn)部分視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層細(xì)胞陽(yáng)性染色。載體對(duì)照及陰性對(duì)照未見(jiàn)棕色顆粒,僅見(jiàn)甲綠染色顆粒。四、透射電子顯微鏡檢查結(jié)果ES注射后視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)清晰,排列正常,細(xì)胞核圓形或橢圓形,染色質(zhì)分布正常,可見(jiàn)外界膜(圖7,8)。討論一、糖尿病視網(wǎng)膜病變動(dòng)物模型的評(píng)價(jià)視網(wǎng)膜新生血管的動(dòng)物模型有多種,各有其優(yōu)缺點(diǎn)?？刹捎秒娔⒐饽确椒ㄔ斐蓜?dòng)物視網(wǎng)膜的靜脈阻塞,伴發(fā)一定比例的眼內(nèi)新生血管。這種動(dòng)物模型的優(yōu)點(diǎn)是可以選取較大的動(dòng)物模型,缺點(diǎn)是新生血管的形成率僅為50%,另外此種新生血管在熒光素眼底血管造影中熒光素不易滲漏,需通過(guò)組織學(xué)檢查來(lái)評(píng)定結(jié)果。糖尿病動(dòng)物模型有多種,但常因眼底僅為背景期的糖尿病視網(wǎng)膜病變?cè)谝暰W(wǎng)膜新生血管的研究中受到限制。目前應(yīng)用最為廣泛的方法即采用氧致血管增生性視網(wǎng)膜病變的動(dòng)物模型。小鼠模型新生血管的發(fā)生率為100%且可重復(fù)性好,而且有可定量的最大優(yōu)點(diǎn),已成為探索視網(wǎng)膜新生血管發(fā)生機(jī)制和新生血管治療方法療效評(píng)價(jià)的主要實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型之一。C57Bl/6J小鼠生后2周內(nèi)視網(wǎng)膜血管發(fā)育尚不成熟,此時(shí)給予高氧的環(huán)境,抑制血管的發(fā)育成熟,而回到正常環(huán)境中后可以引發(fā)缺血、缺氧,從而使新生血管生長(zhǎng)。評(píng)價(jià)新生血管的指標(biāo)有兩種,一種是可以通過(guò)視網(wǎng)膜鋪片上血管生長(zhǎng)的范圍密度、新生血管芽的多少來(lái)反映視網(wǎng)膜新生血管的增殖程度。另一種方法即通過(guò)組織學(xué)計(jì)數(shù)切片上血管內(nèi)皮細(xì)胞突破內(nèi)界膜的數(shù)目反映新生血管的增生狀態(tài)。前者是定性方法,后者是定量方法。我們?cè)谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)采用此方法建立的新生血管動(dòng)物模型中,100%的小鼠發(fā)生視網(wǎng)膜新生血管,與國(guó)外同類報(bào)道一致。二、局部和局部相互影響的原因多項(xiàng)研究表明ES是一種內(nèi)源性新生血管抑制因子,可以特異性抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖。有研究報(bào)道動(dòng)物實(shí)驗(yàn)可通過(guò)抑制腫瘤新生血管的生長(zhǎng)從而抑制多種腫瘤的生長(zhǎng)。攜帶ES的各種載體進(jìn)行全身或局部的基因轉(zhuǎn)移也取得較好效果。ES是否對(duì)眼部新生血管有抑制作用?對(duì)此我們采用小鼠新生血管模型局部轉(zhuǎn)移ES基因的方法觀察ES對(duì)視網(wǎng)膜新生血管的作用。在本研究中,ES基因轉(zhuǎn)移使新生血管芽的數(shù)量和程度減少,這可能與ES抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的特性有關(guān)。目前研究認(rèn)為新生血管性疾病的局部存在著刺激因子和抑制因子的平衡。Noma等對(duì)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)和ES水平與糖尿病視網(wǎng)膜病變的關(guān)系進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)房水中和玻璃體中VEGF和ES水平與糖尿病視網(wǎng)膜病變的嚴(yán)重程度相關(guān),兩者之間的濃度差別與糖尿病視網(wǎng)膜病變是否處于活動(dòng)期有關(guān)。另一項(xiàng)研究觀察增生性糖尿病視網(wǎng)膜病變(proliferativediabeticretinopathy,PDR)的玻璃體手術(shù)預(yù)后與玻璃體腔中VEGF和ES水平之間的相關(guān)性,發(fā)現(xiàn)在玻璃體液中VEGF水平在視網(wǎng)膜病變進(jìn)展組較非進(jìn)展組高。相反,ES在非進(jìn)展組較進(jìn)展組高,而且發(fā)現(xiàn)玻璃體中VEGF水平高、ES水平低者術(shù)后發(fā)生糖尿病視網(wǎng)膜病變進(jìn)展的可能性增大。這說(shuō)明促進(jìn)因子水平高一定程度上反映血管處于增生活躍期,抑制因子水平高一定程度上反映了血管增生的相對(duì)穩(wěn)定。我們通過(guò)基因轉(zhuǎn)移的方式,上調(diào)局部的抑制因子水平,對(duì)抗促進(jìn)因子的作用,使血管的增生活躍受到抑制而達(dá)到治療目的。ES基因轉(zhuǎn)移不能完全抑制新生血管的生長(zhǎng),主要有以下幾個(gè)原因。首先視網(wǎng)膜新生血管生長(zhǎng)是一個(gè)較為復(fù)雜的過(guò)程,有多種因子參與。目前認(rèn)為是促進(jìn)因子和抑制因子的平衡開(kāi)關(guān)控制新生血管生長(zhǎng)的過(guò)程。因此可能單一因素不能阻止新生血管的發(fā)生。這提示我們:是否多個(gè)環(huán)節(jié)控制新生血管生長(zhǎng)具有更有效的作用?另外脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移在視網(wǎng)膜的表達(dá)量受到限制,而蛋白因子類的作用效果呈明顯的量效關(guān)系。提高脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)移效率及優(yōu)化轉(zhuǎn)移條件是否在一定程度上提高治療效果是今后所要研究的問(wèn)題。三、動(dòng)物模型新生血管的移植質(zhì)粒DNA與重組病毒相比,具有操作簡(jiǎn)便、可以容納更大的插入序列、容易產(chǎn)生、整合和擴(kuò)散的危險(xiǎn)小等特點(diǎn)。另外質(zhì)粒DNA的抗原性低可以重復(fù)使用。但質(zhì)粒直接注射方法的缺點(diǎn)是效率較低,僅具有非常低的穩(wěn)定整合水平,很難達(dá)到在細(xì)胞中長(zhǎng)期表達(dá)。對(duì)于增殖比較旺盛的細(xì)胞需重復(fù)注射,對(duì)于增殖率較低的細(xì)胞,注入的質(zhì)粒DNA可以達(dá)到持續(xù)基因表達(dá)幾個(gè)月之久。脂質(zhì)體是由脂質(zhì)雙分子組成的環(huán)形封閉囊泡、無(wú)毒、無(wú)免疫原性,脂質(zhì)體DNA復(fù)合物成為非病毒載體基因轉(zhuǎn)移的較好方法。本研究可以看出,基因注射后可以轉(zhuǎn)移至視網(wǎng)膜細(xì)胞,主要位于神經(jīng)節(jié)細(xì)胞和內(nèi)核