SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）

測定蛋白質(zhì)分子量

實驗?zāi)康膶W(xué)習(xí)PAGE分離蛋白質(zhì)的原理學(xué)習(xí)SDS測定蛋白質(zhì)分子量的原理。掌握垂直板電泳的操作方法。運用SDS測定蛋白質(zhì)分子量及染色鑒定。一.PAGE分離蛋白質(zhì)的原理PAGE根據(jù)其有無濃縮效應(yīng)，分為連續(xù)系統(tǒng)和不連續(xù)系統(tǒng)兩大類，連續(xù)系統(tǒng)電泳體系中緩沖液pH值及凝膠濃度相同，帶電顆粒在電場作用下，主要靠電荷和分子篩效應(yīng)。不連續(xù)系統(tǒng)中由于緩沖液離子成分，pH，凝膠濃度及電位梯度的不連續(xù)性，帶電顆粒在電場中泳動不僅有電荷效應(yīng)，分子篩效應(yīng)，還具有濃縮效應(yīng)，因而其分離條帶清晰度及分辨率均較前者佳。聚丙烯酰胺凝膠電泳--PAGE(Polyacryamidegelelectrophoresis)以聚丙烯酰胺凝膠為支持物的電泳方法。由于其分辨率高，不僅能分離含有各種大分子混合物，而且可以研究生物大分子的特性；如電荷、分子量、等電點及分子構(gòu)型。聚丙烯酰胺凝膠的合成丙稀酰胺聚丙烯酰胺凝膠催化劑聚合反應(yīng)聚丙烯酰胺凝膠的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)稀溶液濃溶液－－交聯(lián)劑

凝膠－－結(jié)點T=

X100%a+bmC=x100ba+bC=6.5-0.3T配制凝膠濃度計算及經(jīng)驗公式凝膠濃度的計算聚合后的聚丙烯酰胺凝膠的強度、彈性、透明度、粘度和孔徑大小均取決于兩個重要參數(shù)T和C，T是丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺兩個單體的總百分濃度。C是與T有關(guān)的交聯(lián)百分濃度。T與C的計算公式是：上式中a為丙烯酰胺的克數(shù)，b為甲叉雙丙烯酰胺的克數(shù)，m為水或緩沖液體積（ml）。式中a與b的比例很重要。富有彈性，且完全透明的凝膠，a與b的重量比應(yīng)在30左右。）

聚丙烯酰胺的聚合及影響因素①化學(xué)聚合：以過硫酸銨（AP）為催化劑，以四甲級乙二胺（TEMED）為加速劑，使丙稀酰胺、甲基雙丙稀酰胺發(fā)生連鎖反應(yīng)形成網(wǎng)狀的聚合物。丙稀酰胺由過硫酸銨（AP）在堿性條件下產(chǎn)生游離氧自由基引發(fā)單體丙稀酰胺成為自由基狀態(tài)而成的。在堿性PH時，反應(yīng)速率迅速；而在酸性條件時，同樣濃度溶液，聚合速率減慢。在低溫時聚合，凝膠會變得脆而渾濁，且重復(fù)性差，在25℃聚合的凝膠則較透明和有彈性。分子氧的存在會阻礙凝膠的化學(xué)聚合，O2使過硫酸銨（AP）分解。故在做膠后常要用水進行封閉；金屬離子也干擾凝膠的化學(xué)聚合。②光聚合：以核黃素為催化劑在少量的氧存在下,分解成無色的還原型，在少量的O2條件下，還原型的核黃素氧化成有游離基的黃素環(huán)，聚合反應(yīng)發(fā)生。用量少，不會對樣品有任何不良的干擾現(xiàn)象；故常用于樣品膠的聚合；聚合的時間可以自由控制缺點：光照的量不容易掌握，重現(xiàn)性不太好；光聚合適合大孔徑凝膠的聚合，化學(xué)聚合適合各種凝膠的聚合。核黃素B1還原型游離基聚合反應(yīng)光照O2

聚丙烯酰胺凝膠的孔徑和分子篩效應(yīng)凝膠是具有高粘度、高摩擦阻力的支持介質(zhì)，能起到防止對流，把擴散減到最小，而且能影響大分子顆粒的移動過程。大分子在凝膠中的分離是受其所帶的電荷、尺寸、和形狀因素的影響．凝膠的這種用于分離不同尺寸分子的特性是由于它的尺寸篩分能力（Sizesievingcapacity），故將此現(xiàn)象稱為分子篩效應(yīng)（Molecularsievingeffect）.有效孔徑取決于凝膠的總濃度T％，孔徑隨著T%的增加而減小。甲基雙丙稀酰胺的濃度為5%時，有效孔徑最??；T=5%時，甲基雙丙稀酰胺的濃度為5%時，孔徑為20nm。T是凝膠溶質(zhì)的總百分濃度，C是與總濃度相關(guān)的交聯(lián)百分濃度。故T是決定C，分離物的分子量的大小又決定了T的濃度。

579111315T%AB凝膠濃度T對樣品遷移率的影響例：混合蛋白質(zhì)A,B，A分子量較小，B分子帶電荷較多，T＝5％時，電泳行為主要以電荷起作用，B遷移速度快。當T增加，分子篩效應(yīng)增加，B的遷移速度減慢；T＝9％時，A，B的遷移率相同，不能分開，T再增加，凝膠孔徑更小，A分子比B分子小，表現(xiàn)較高的遷移率。并且說明電泳只獲得單一的帶時，并不能證明是單一的均一成分。遷移率

不連續(xù)凝膠電泳（disc）的分離原理(一).原理不連續(xù)凝膠電泳系統(tǒng)具有與一般電泳的①

電荷效應(yīng)分離外，還具有②濃縮效應(yīng)與③分子篩效應(yīng)，因而，能提高電泳的分辨率；使電荷性質(zhì)與密度相近的但分子量有差別的分子得以分離；或分子量相近、性質(zhì)一樣、電荷性質(zhì)與密度有差別的分子可以分離；或電荷性質(zhì)、分子量大小相近，但構(gòu)型不同時亦可分離。堿性不連續(xù)－分離酸性樣品不連續(xù)凝膠電泳洗脫酸性不連續(xù)－分離堿性樣品大多數(shù)蛋白質(zhì)分子呈酸性或中性，適合用堿性系統(tǒng)進行電泳分離。①.濃縮效應(yīng)

1.凝膠的組成：濃縮膠為大孔徑（稀）T＜5％，分離膠一般為小孔徑（濃）T﹥7.5％。樣品在較稀的凝膠上自由遷移，直至濃凝膠時，便形成一道柵欄，所有的樣品分子在濃縮膠的界面堆積成一窄帶，得到濃縮，然后，再依據(jù)分子量的大小進行電泳分離。2.緩沖液的組成:圖示。PH系統(tǒng)的不連續(xù)，各種分子的電荷之間的差異進行分離。3.緩沖體系的不連續(xù)，其中各組成的離子、快慢離子遷移快慢的差別是影響樣品濃縮效應(yīng)的重要因素。4.離子的遷移速率及濃度的不連續(xù)又造成電場強度與電導(dǎo)率的變化。②分子篩效應(yīng)移動界面到達濃縮膠和分離膠界面時，凝膠的PH變化明顯，緩沖液中甘氨酸的觧離迅速增加，直至完全觧離出gly-,其分子量小，遷移超過蛋白質(zhì)分子。而喪失夾擊的作用；同時，凝膠的孔徑變小，降低了蛋白質(zhì)的遷移率。故蛋白質(zhì)分子在均一的電壓梯度和PH值中泳動，依其分子量的大小而分開。③電荷效應(yīng)

蛋白質(zhì)所帶的凈電的性質(zhì)和電荷量與分子的遷移率的關(guān)系，在同一電場強度中，在單位時間內(nèi)各分子遷移的距離的差別而到達分離。操作垂直柱狀，板狀的不連續(xù)凝膠電泳系統(tǒng)的組成和配制；均一凝膠與梯度凝膠配制；電極緩沖液系統(tǒng)；樣品的準備；加樣要求電泳檢測PH8.3PH6.7PH8.9PH8.3垂直柱狀，板狀的不連續(xù)凝膠電泳系統(tǒng)的組成和配制緩沖液系統(tǒng)濃縮凝膠緩沖液0.5mol/LTris-HCl,PH6.8分離凝膠緩沖液1.5mol/LTris-HCl,PH8.8電極緩沖液系統(tǒng)0.025mol/LTris（三羥甲基氨基甲烷）0.2mol/Gly(甘氨酸)PH8.3樣品緩沖液0.1mol/LTris-HCl,PH6.8,40%甘油、0.05mg/ml溴酚藍樣品緩沖液的要求：選擇合適的PH與離子強度，以保證樣品的溶解性、穩(wěn)定性、生物活性。并加入便于觀察電泳前沿的指示劑。標準蛋白質(zhì)樣品標準蛋白質(zhì)樣品：是一組（5～7種）已知的合適的分子量范圍的、構(gòu)形相近的一套蛋白質(zhì)，溶解在樣品緩沖液中備用。樣品的濃度分析目的、檢測方法和樣品的組成是關(guān)鍵；未知樣品濃度：0.1～20mg/ml考瑪斯亮籃染色：1～2mg/ml銀染色:0.02～0.2mg/ml高純度樣品：0.5～2mg/ml加樣電泳

光吸收檢測考瑪斯亮籃染色染色銀染色

二、

SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）測定蛋白質(zhì)的分子量

SDS，主要用于測定蛋白質(zhì)亞基的分子量。與其它方法相比，它不需要昂貴的儀器設(shè)備，操作簡便，能在較短的時間內(nèi)得到結(jié)果，有較高的重復(fù)性。且不需要非常純的樣品，因此是目前用于測定蛋白質(zhì)亞基的分子量的一種最好的方法。實驗原理SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，是在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中引進SDS（十二烷基硫酸鈉），SDS能斷裂分子內(nèi)和分子間氫鍵，破壞蛋白質(zhì)的二級和三級結(jié)構(gòu)，強還原劑能使半胱氨酸之間的二硫鍵斷裂，蛋白質(zhì)在一定濃度的含有強還原劑的SDS溶液中，與SDS分子按比例結(jié)合，形成帶負電荷的SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物，這種復(fù)合物由于結(jié)合大量的SDS，使蛋白質(zhì)喪失了原有的電荷狀態(tài)形成僅保持原有分子大小為特征的負離子團塊，從而降低或消除了各種蛋白質(zhì)分子之間天然的電荷差異，由于SDS與蛋白質(zhì)的結(jié)合是按重量成比例的，因此在進行電泳時，蛋白質(zhì)分子的遷移速度取決于分子大小。當分子量在15KD到200KD之間時，蛋白質(zhì)的遷移率和分子量的對數(shù)呈線性關(guān)系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW為分子量，X為遷移率，k、b均為常數(shù)，若將已知分子量的標準蛋白質(zhì)的遷移率對分子量對數(shù)作圖，可獲得一條標準曲線，未知蛋白質(zhì)在相同條件下進行電泳，根據(jù)它的電泳遷移率即可在標準曲線上求得分子量。實驗原理

SDS電泳的成功關(guān)鍵之一是電泳過程中，特別是樣品制備過程中蛋白質(zhì)與SDS的結(jié)合程度。影響它們結(jié)合的因素主要有三個：溶液中SDS單體的濃度，當單體濃度大于1mmol/L時大多數(shù)蛋白質(zhì)與SDS結(jié)合的重量比為1:1.4，如果單休濃度降到0.5mmol/L以下時，兩者的結(jié)合比僅為1:0.4這樣就不能消除蛋白質(zhì)原有的電荷差別，為保證蛋白質(zhì)與SDS的充分結(jié)合，它們的重量比應(yīng)該為1:4或1:3樣品緩沖液的離子強度。SDS電泳的樣品緩沖液離子強度較低，通常是10～100mmol/L二硫鍵是否完全被還原實驗原理采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測蛋白質(zhì)分子量時，只有完全打開二硫鍵，蛋白質(zhì)分子才能被解聚，SDS才能定量地結(jié)合到亞基上而給出相對遷移率和分子量對數(shù)的線性關(guān)系。因此在用SDS處理樣品同時往往用巰基乙醇處理，巰基乙醇是一種強還原劑，它使被還原的二硫鍵不易再氧化，從而使很多不溶性蛋白質(zhì)溶解而與SDS定量結(jié)合。有許多蛋白質(zhì)是由亞基（如血紅蛋白）或兩條以上肽鏈（如胰凝乳蛋白酶）組成的，它們在SDS和巰基乙醇作用下，解離成亞基或單條肽鏈，因此這一類蛋白質(zhì)，測定時只是它們的亞基或單條肽鏈的MW。已發(fā)現(xiàn)有些蛋白質(zhì)不能用SDS測定分子量。如電荷異常或構(gòu)象異常的蛋白質(zhì)，帶有較大輔基的蛋白質(zhì)（某些糖蛋白）以及一些結(jié)構(gòu)蛋白，如膠原蛋白等。一般至少采用兩種方法測定未知樣品的分子量，互相驗證。實驗試劑和器材

1.材料：

低分子量標準蛋白試劑盒:

低分子量標準蛋白：兔磷酸化酶BMW=97,400

牛血清白蛋白MW=66,200

兔肌動蛋白MW=43,000

牛碳酸酐酶MW=31,000

胰蛋白酶抑制劑MW=20,100

雞蛋清溶菌酶MW=14,400

根據(jù)說明書處理標準蛋白

樣品：稱3mg樣品，加2ml蒸餾水溶解。2.實驗試劑

(1)30%丙烯酰胺（Acr）：稱Acr30g，甲叉雙丙烯酰胺

（Bis）0.8g，加蒸餾水至100ml，過濾后置棕色瓶中，

4℃貯存可用1-2月。

（2）10%SDS（十二烷基硫酸鈉）

（3）1.5mol/LpH8.8Tris-HCl分離膠緩沖液：稱取

Tris18.2g加入50ml水，用1mol/L鹽酸調(diào)pH8.9，最

后用蒸餾水定容至100ml。

（4）1.0mol/LpH6.8Tris-HCl濃縮膠緩沖液：稱取

Tris12.1g，加入50ml水，用1mol/L鹽酸調(diào)pH6.8，

最后用蒸餾水定容至100ml。

（5）0.05mol/LpH6.8Tris-HCl樣品溶解緩沖液：稱取

Tris0.6g，加入50ml水，用1mol/L鹽酸調(diào)pH6.8，最

后用蒸餾水容至100ml。

（7）10%過硫酸銨(AP)

（8）TEMED（四甲基乙二胺）

（9）樣品溶解液：SDS（100mg）+巰基乙醇（0.1ml）+

溴酚藍（2mg）+甘油（2g）+0.05mol/LpH8.3Tris-

HCl（2ml），最后定容至10ml。