免疫熒光顯微術(shù)Immunofluorescentmicroscope

熒光顯微鏡技術(shù)是根據(jù)標(biāo)本本身的熒光反應(yīng)物質(zhì)具有吸收由熒光源發(fā)出的激發(fā)光能而呈現(xiàn)熒光的現(xiàn)象，或利用組織及細(xì)胞內(nèi)某成分可與熒光染料結(jié)合，并受到熒光激發(fā)后呈現(xiàn)出特定顏色熒光的原理，用熒光顯微鏡進行觀察，對待測物質(zhì)進行定性、定量和定位的技術(shù)。免疫熒光（immunofluorescence，IF）定位是利用抗體與生物分子（抗原）的特異性結(jié)合，通過熒光結(jié)合抗體對抗原的特異性標(biāo)記顯現(xiàn)圖像，從而對標(biāo)本中的抗原進行定性、定量和定位。由于熒光與標(biāo)本黑暗的背景對比強烈，所以熒光顯微術(shù)的靈敏度非常高。熒光強度與激發(fā)光的量及熒光染料的量成線性比例關(guān)系，因此可以根據(jù)鏡下熒光強度對標(biāo)本中的抗原進行定量測定。目前，免疫熒光顯微術(shù)已廣泛應(yīng)用于研究胚胎發(fā)育、病理組織、癌癥及正常細(xì)胞表型，植物、真菌、細(xì)菌、病毒、亞細(xì)胞定位，以及抗原的輔助定位等。該技術(shù)的關(guān)鍵是抗體的特異性、標(biāo)本的制備、自身熒光、顯微鏡的使用及操作者。抗體特異性取決于免疫時用的抗原的純度，使用親和純化的多克隆抗體或單克隆抗體可以獲得滿意的結(jié)果。自身熒光通常限制細(xì)胞和組織中熒光抗體探針的可檢測性。

通過光譜辨別（spectrumdiscrimination）可以將自身熒光的影響減至最低。光譜辨別包括選擇適當(dāng)?shù)奶结樅蜑V光器以使探針的熒光信號相對于自身熒光之比達到最大。哺乳動物細(xì)胞中自身熒光物質(zhì)主要是黃素輔酶（FDA和FMN，吸收光波長為450nm，發(fā)射光波長為515nm）和還原型吡啶核苷酸（NADH，吸收光波長340nm，發(fā)射光波長為460nm）。植物的自身熒光物質(zhì)常是木質(zhì)素，產(chǎn)生綠色熒光；卟啉，如葉綠素，產(chǎn)生長波長的紅色熒光。因此，在IF中使用發(fā)射藍光的短波長熒光染料比較好。對于固定細(xì)胞，在抗體孵育前先用含0.1％硼氫化鈉的PBS溶液漂洗30min，可顯著地減低自身熒光。1.熒光顯微鏡及其附屬設(shè)備

熒光顯微鏡觀察是在光學(xué)顯微鏡水平上對蛋白質(zhì)和亞細(xì)胞組分進行定位的最常用的方法一。熒光顯微鏡由光源、濾片和顯微鏡三個系統(tǒng)組成。（一）光源熒光顯微鏡的光源系統(tǒng)是應(yīng)用高壓汞燈，該燈能以最小的表面積釋放出最大量的短波光源（紫外線）。由啟動裝置控制，每次啟動可工作2～3h。其使用壽命與啟動次數(shù)、工作時間密切相關(guān)，故在使用時避免頻繁啟動而損壞電極。

（二）濾片系統(tǒng)濾片系統(tǒng)包括激發(fā)濾片、阻斷濾片和吸熱濾片。

1．激發(fā)濾片：大多以其所表現(xiàn)的光譜基本色調(diào)性質(zhì)命名。（1）UV激發(fā)濾片激發(fā)光通常為波長365～400nm的紫外線。該濾片適于櫻草素（primulin）、硫磺素（thioflavine）、Hoechst33258及Hoechst33342等熒光染色觀察。（2）V干涉激發(fā)濾片：激發(fā)光為波長410～420nm的紫光。適于單胺類的熒光觀察。（3）BV激發(fā)濾片：激發(fā)光為波長404～435nm的藍紫光。適于吖啶橙及異硫氰酸熒光素（faluoresceinisothiocyanate,FITC）標(biāo)記抗體的免疫熒光染色觀察。（4）B干涉激發(fā)濾片：激發(fā)光為波長490nm的藍光。也適于FITC標(biāo)記抗體的免疫熒光觀察。（5）G干涉激發(fā)濾片：激發(fā)光為波長520～550nm。適于四甲基異硫氰酸羅丹明（TRITC）標(biāo)記抗體的免疫熒光染色觀察。2.阻斷濾片：在光路中吸收那些經(jīng)過標(biāo)本后未被標(biāo)本轉(zhuǎn)化，吸收而射到視野的激發(fā)光，起保護觀察者眼睛的作用。激發(fā)與阻斷濾片配合使用的范圍。3.吸熱濾片：由于光源都含有一定量的紅光而產(chǎn)生熱量，此類濾片具有吸收熱量的作用。（三）熒光顯微鏡熒光顯微鏡依照光路照射方向分為透射式和落射式兩種。大部分熒光顯微鏡兼有透射和落射兩種功能。通過改變光路中的反光鏡可以進行透射光或落射光熒光觀察。2.抗體標(biāo)記抗體與抗原的結(jié)合方法：直接法和間接法。直接法是將帶有標(biāo)記的抗體與抗原反應(yīng)，顯示出抗原存在的部位。間接法是在抗體抗原初級反應(yīng)的基礎(chǔ)上，再用帶標(biāo)記的次級抗體同初級抗體反應(yīng)，從而使初級反應(yīng)得到放大，顯示增強。

圖免疫細(xì)胞化學(xué)直接法（A）與間接法（B）示意圖3.熒光染料

熒光染料是否發(fā)射熒光及熒光的強弱主要決定于該染料的分子結(jié)構(gòu)，同時與其所處的環(huán)境及其狀態(tài)也有密切的關(guān)系。如：染色液的pH、濃度和染色時的溫度等均對熒光效應(yīng)有一定的影響。在進行熒光染色時，還要注意避免與對熒光有淬滅作用的物質(zhì)接觸。例如鹵酸鹽，碘離子作用最強，其次為溴離子，而氯離子作用最??；金屬離子，如鐵離子、銀離子等對熒光亦有淬滅作用。

熒光素是免疫熒光術(shù)中最常用的熒光染料，經(jīng)紫外光（<400nm）或藍光（常為490nm）激發(fā)后，發(fā)射出綠色熒光（500~550nm），其波長范圍正是暗適應(yīng)時眼睛最敏感的范圍，而且顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)也能進行最佳校準(zhǔn)。羅丹明、伊紅、四甲基羅丹明、Texas紅也是常用的熒光染料，其激發(fā)光波長為520~590nm，發(fā)射光波長為550~620nm，可通過一個異硫氰酸基團與抗體相連。一般來說，由于眼睛對黃光、紅光比藍光敏感，所以黃色和紅色熒光染料比藍色熒光染料更有用。藍色熒光染料常需紫外線激發(fā)，還可能損傷許多細(xì)胞結(jié)構(gòu)，并易使細(xì)胞產(chǎn)生自發(fā)熒光。

許多熒光染料也可與毒素結(jié)合。每種毒素特異性結(jié)合一種細(xì)胞靶結(jié)構(gòu)，從而能夠顯示這些細(xì)胞結(jié)構(gòu)。例如，熒光毒傘素用于標(biāo)記細(xì)胞的絲狀肌動蛋白（F肌動蛋白）。DAPI是用于熒光標(biāo)記雙鏈DNA最常用的熒光染料。圖2（a）上皮細(xì)胞（b）細(xì)胞線粒體（c）肌動蛋白（d）HeLa細(xì)胞(AlexaFluor546共軛毒傘素)（e）非洲綠猴腎細(xì)胞肌動蛋白（f）棕櫚樹組織DAPI與A-T堿基結(jié)合后，其熒光比處于溶液中的自由狀態(tài)或與G-C堿基結(jié)合的熒光強約20倍。DAPI可用于顯示支原體污染及線粒體，但最常用于顯示細(xì)胞核和染色體。缺點是，在多色成像中，用360nm的光激發(fā)時，DAPI發(fā)射的光太亮，從而掩蓋了其他的熒光信號，可改用405nm的光作為激發(fā)光。長波長的光不僅能很好地激發(fā)DNA，還可減少對細(xì)胞的損害，而且也減少對其他熒光染料的漂白作用。由于DAPI有足夠的明亮度，故仍是標(biāo)準(zhǔn)的DNA熒光染料。三、用酶標(biāo)法檢測細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的定位（一）原理免疫酶標(biāo)技術(shù)（ImmunoenzymaticTechnique）是指用酶標(biāo)記抗體或酶標(biāo)記抗抗體進行抗原－抗體反應(yīng)。這種標(biāo)記物可同時保留抗體的免疫特性和酶的活性。用酶標(biāo)記抗體與抗原結(jié)合后，需再滴加酶的底物過氧化氫（H2O2）和供氫體二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidineterrahydrochloride，DAB）。酶和底物反應(yīng)后可產(chǎn)生有色沉淀物，借助一般光學(xué)顯微鏡或電子顯微鏡進行定位、定性研究，也可應(yīng)用光電比色計或酶標(biāo)儀進行定量測定。采用酶檢測法常遇到的問題及解決方法（1）內(nèi)源性細(xì)胞酶活性的存在對反應(yīng)結(jié)果的影響：雖然細(xì)胞內(nèi)源性酶活性的問題并不是普遍存在，但有些細(xì)胞和組織有內(nèi)源性的過氧化物酶（如巨噬細(xì)胞、骨髓細(xì)胞及紅細(xì)胞）或堿性磷酸酶（如胎盤、小腸），這些內(nèi)源性酶活性的存在會給實驗結(jié)果的判定帶來麻煩。

如果已知或懷疑存在內(nèi)源性過氧化物酶活性，可以用含有1％乙酸的甲醇室溫處理15min，或用含0.03％H2O2的甲醇室溫處理30min。如果是經(jīng)乙醛固定過