水溶苯胺藍褪色光度法測定殼聚糖的含量【摘要】目的建立殼聚糖的含量測定新方法。方法利用分光光度法研究殼聚糖與水溶苯胺藍的超分子反應條件，并建立分析方法。結(jié)果在pH時水溶苯胺藍與殼聚糖發(fā)生了超分子褪色反應，所擬方法用于殼聚糖的測定，結(jié)果與溴甲酚綠法一致。結(jié)論所擬方法簡單，快速，用于殼聚糖的測定結(jié)果準確、可靠。

【關(guān)鍵詞】殼聚糖；水溶苯胺藍；光度法

殼聚糖(CTS)是自然界中唯一的堿性多糖，它是天然產(chǎn)物甲殼素經(jīng)化學法處理脫乙?；蟮漠a(chǎn)物一致。

1儀器與試劑

722N可見分光光度計；BS-210型萬分之一的電子天平。

100μg/ml的殼聚糖標準溶液：稱取0g殼聚糖，置于燒杯中，用mol/L的醋酸溶解，轉(zhuǎn)入1000ml容量瓶中，以水稀釋至刻度，搖勻，備用；5×10-4mol/L水溶苯胺藍溶液：稱取水溶苯胺藍4g，置于燒杯中加水溶解，轉(zhuǎn)入500ml容量瓶中，以水稀釋至刻度，搖勻，備用；pH=Britton-Robinson緩沖液［10］。

2方法

準確移取適量100μg/ml的殼聚糖標準溶液，置于10ml的潔凈比色管中，依次加入ml5×10-4mol/L水溶苯胺藍溶液，mlpH=Britton-Robinson緩沖液，再用水定容至刻度線，搖勻。同時配制試劑空白溶液，以測定溶液為參比，用1cm比色皿在波長610nm處測定試劑空白的吸光度A。

3結(jié)果與討論

測試波長的選擇

準確移取100μg/ml的殼聚糖標準溶液ml，置于10ml的潔凈比色管中，以下同“方法”項下操作,在波長為500～700nm范圍內(nèi)測定溶液的吸光度，并繪制吸收光譜；同時配制試劑空白溶液，同樣繪制吸收光譜，結(jié)果如圖1所示，以水為參比時試劑空白水溶苯胺藍的最大吸收波長在600nm處，以水為參比的測定液的最大吸收波長在570nm處，而以測定液為參比的相應試劑空白的最大吸收波長在610nm處，說明殼聚糖與水溶苯胺藍之間的反應是褪色反應，褪色的最大吸收波長與水溶苯胺藍相比，僅紅移10nm。故選擇610nm為測試波長。

pH的影響

通常顯色反應中酸度或pH是影響反應的重要因素之一。為此考察了pH值對反應的影響。對于在“方法”項下，其它條件不變，僅改變試液的緩沖溶液pH值，結(jié)果如圖2所示，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著體系pH的升高，體系的吸光度逐漸變大；pH在～范圍內(nèi)體系的吸光度最大且穩(wěn)定。當pH大于是吸光度變小。故選擇測試波長的選擇pH=Britton-Robinson緩沖液來控制體系的酸度。實驗還發(fā)現(xiàn)pH=Britton-Robinson緩沖液用量在～ml內(nèi)時體系吸光度最大且穩(wěn)定，故選用ml。

試劑用量的影響

水溶苯胺藍作為殼聚糖的褪色標記試劑，它的加入量直接影響反應體系中超分子復合物的生成，對于100μg/ml的殼聚糖來說，在“方法”項下，其它條件不變，僅改變水溶苯胺藍溶液的用量，實驗結(jié)果如圖3所示，隨著水溶苯胺藍用量的增加，體系的吸光度逐漸增大；當其用量在ml時體系的吸光度最大且穩(wěn)定；當其用量超過ml時體系吸光度反而變小。故選用ml5×10-4mol/L水溶苯胺藍溶液作為殼聚糖的標記試劑。

時間的影響

對于100μg/ml的殼聚糖來說，在“方法”項下，其它條件不變，僅改變反應時間，結(jié)果表明，體系的吸光度穩(wěn)定不受時間影響。

工作曲線及線性范圍

在一組10ml的比色管中，分別準確加入濃度為100μg/ml的殼聚糖標準溶液，，，，，，ml，依次加入ml5×10-4mol/L水溶苯胺藍和mlpH=Britton-Robinson緩沖液。以下按“方法”項下操作測定610nm處的吸光度A，并繪制工作曲線，結(jié)果如圖4所示，其工作曲線的回歸方程為A=901C(C的單位為μg)+10,相關(guān)系數(shù)R=9，殼聚糖在10～120μg/10ml內(nèi)服從比爾定律，測定的摩爾吸光系數(shù)ε為×107L·mol-1·cm-1。

干擾物質(zhì)的影響

對于100μg的殼聚糖來說，以相對誤差在±5℅范圍內(nèi)，考察了一些干擾物質(zhì)的影響，這些物質(zhì)的允許量如下：K+，F(xiàn)e2+，Mo(VI)，Cu2+，Al3+，Zn2+，Ba2+；氨基乙酸、維生素C、葡萄糖酸鋅；Cr3+、Co2+、左旋肉堿、維生素E。說明使用本方法用于殼聚糖的測定具有較好的選擇性。

樣品分析

取含殼聚糖的膠囊10粒，將其內(nèi)容物混合均勻，稱重。準確稱取殼聚糖樣品，置于燒杯中，用mol/L的醋酸溶解后轉(zhuǎn)入1000ml容量瓶中，以水稀釋至刻度，搖勻，備用。準確移取該樣品溶液ml，置于10ml的潔凈比色管中，以下按“方法”項下操作測定610nm處的吸光度A，平行測定11次，結(jié)果見表1，與溴甲酚綠法［5］所得結(jié)果一致。表1樣品分析結(jié)果

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