基層醫(yī)院如何開展臨床微生物檢測(cè)襄陽(yáng)市中心醫(yī)院臨床檢驗(yàn)部微生物室鄒玖明為什么要開展臨床微生物檢測(cè)？----必要性如何開展臨床微生物檢測(cè)？----軟硬件設(shè)施建立！細(xì)菌鑒定基本知識(shí)及技能！有關(guān)抗菌藥物敏感性實(shí)驗(yàn)的方法學(xué)！保證檢驗(yàn)質(zhì)量的準(zhǔn)確性！----質(zhì)量控制為什么要開展臨床微生物檢測(cè)？最重要的兩個(gè)原因：不斷增加的細(xì)菌耐藥性！促進(jìn)抗生素的合理使用！政策性文件衛(wèi)醫(yī)發(fā)〔2004〕285號(hào):衛(wèi)生部關(guān)于施行<抗菌藥物臨床應(yīng)用指導(dǎo)原則>的通知衛(wèi)辦醫(yī)發(fā)〔2006〕133號(hào)：衛(wèi)生部辦公廳關(guān)于進(jìn)一步做好抗菌藥物臨床應(yīng)用和細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)工作的通知衛(wèi)辦醫(yī)發(fā)〔2008〕48號(hào):衛(wèi)生部辦公廳關(guān)于進(jìn)一步加強(qiáng)抗菌藥物臨床應(yīng)用管理的通知衛(wèi)辦醫(yī)發(fā)〔2008〕130號(hào):衛(wèi)生部辦公廳關(guān)于加強(qiáng)多重耐藥菌醫(yī)院感染控制工作的通知衛(wèi)辦醫(yī)政發(fā)〔2009〕38號(hào)：衛(wèi)生部辦公廳關(guān)于抗菌藥物臨床應(yīng)用管理有關(guān)問題的通知衛(wèi)生部文件：

加強(qiáng)對(duì)抗菌藥物臨床應(yīng)用的指導(dǎo)和監(jiān)管

醫(yī)療機(jī)構(gòu)要加強(qiáng)臨床微生物檢測(cè)與細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)工作根據(jù)全國(guó)和本地區(qū)細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)結(jié)果，結(jié)合本機(jī)構(gòu)實(shí)際情況，建立、完善抗菌藥物臨床應(yīng)用與細(xì)菌耐藥預(yù)警機(jī)制，并采取相應(yīng)的干預(yù)措施各級(jí)地方衛(wèi)生行政部門要逐步建立、健全本轄區(qū)抗菌藥物臨床應(yīng)用與細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)管理體系開展對(duì)醫(yī)療機(jī)構(gòu)抗菌藥物臨床應(yīng)用的評(píng)價(jià)和指導(dǎo)抗生素的中國(guó)式濫用！

一個(gè)鮮明的對(duì)比：

醫(yī)院抗菌藥物年使用率

-----2006-2007年度衛(wèi)生部全國(guó)細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)★世界上沒有哪個(gè)國(guó)家如此大規(guī)模地使用抗生素★74%中國(guó)22%~25%美英等發(fā)達(dá)國(guó)家VS＊中國(guó)的住院患者中抗生素的使用率高達(dá)70%，其中外科患者幾乎人人都用抗生素，比例高達(dá)97%。如何開展臨床微生物檢測(cè)？軟硬件設(shè)施建立：★人員素質(zhì)★儀器設(shè)備★標(biāo)準(zhǔn)化的操作體系人員素質(zhì)◆應(yīng)該掌握臨床微生物基本知識(shí)；◆掌握細(xì)菌鑒定及藥敏試驗(yàn)基本操作技能；◆掌握常用培養(yǎng)基的配制；◆熟悉微生物檢驗(yàn)室內(nèi)質(zhì)量控制規(guī)則。需配備的設(shè)施條件、儀器設(shè)備◆設(shè)施條件：符合生物安全的獨(dú)立實(shí)驗(yàn)用房，分區(qū)設(shè)置合理（樣本處理區(qū)、無(wú)菌區(qū)、轉(zhuǎn)種區(qū)）?！魞x器設(shè)備：超凈工作臺(tái)（生物安全柜）、高壓滅菌器、普通培養(yǎng)箱、CO2培養(yǎng)箱（燭缸）、冰箱、接種環(huán)、電熱滅菌器（酒精燈）、光學(xué)顯微鏡等。需配備的設(shè)施條件、儀器設(shè)備◆試劑：接種標(biāo)本用：哥倫比亞血平板、麥康凱平板、巧克力平板、真菌顯色平板、淋球菌平板等；細(xì)菌鑒定用：氧化酶、觸酶、靛基質(zhì)、甲基紅、VP、枸櫞酸鹽、氨基酸脫羧酶、膽汁七葉苷、6.5%NaCL等；藥敏實(shí)驗(yàn)用：各種抗生素紙片、MH平板、HTM平板等；觀察細(xì)菌形態(tài)用：革蘭染液、抗酸染液?！糍|(zhì)控菌株：ATCC來(lái)源、室間質(zhì)評(píng)來(lái)源。藥敏質(zhì)控必備的三個(gè)菌株：大腸埃希菌ATCC25922銅綠假單胞菌ATCC27853金黃色葡萄球菌ATCC25923

應(yīng)該建立一套微生物檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)化操作體系，其參考資料可以來(lái)源于：《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》、《試劑盒說明書》、定期更新的CLSI文件等。

體系內(nèi)應(yīng)該包含但不限于以下內(nèi)容：各級(jí)檢驗(yàn)人員的職責(zé)和權(quán)限實(shí)驗(yàn)室安全措施各類標(biāo)本采集和處理方法細(xì)菌檢驗(yàn)項(xiàng)目培養(yǎng)基和試劑的配制方法室內(nèi)和室間質(zhì)量控制

★操作體系應(yīng)該每年進(jìn)行一次評(píng)估，適時(shí)更新。標(biāo)準(zhǔn)化操作體系細(xì)菌鑒定基本知識(shí)細(xì)菌形態(tài)結(jié)構(gòu)-----顯微鏡下觀察菌落形態(tài)特征如何利用生化反應(yīng)鑒定細(xì)菌細(xì)菌的形態(tài)

細(xì)菌主要有三種形態(tài)，即球形、桿形、螺形。據(jù)此將細(xì)菌分為三大類：球菌、桿菌、螺形菌。球菌1、雙球菌如腦膜炎雙球菌2、鏈球菌如乙型溶血性鏈球菌3、葡萄球菌如金黃色葡萄球菌腦膜炎奈瑟菌鏈球菌葡萄球菌桿菌單桿菌如大腸桿菌鏈桿菌如炭疽芽孢桿菌棒狀桿菌如白喉棒狀桿菌分枝桿菌如結(jié)核分枝桿菌球桿菌不同桿菌的大小、長(zhǎng)短、粗細(xì)很不一致。炭疽芽胞桿菌3-10μm大中大腸埃希菌2-3μm小布魯菌0.6-1.5μm桿菌的形態(tài)多樣兩端齊平炭疽芽胞桿菌兩端尖細(xì)白喉棒狀桿菌掌握細(xì)菌的鏡下形態(tài)結(jié)構(gòu)對(duì)于細(xì)菌鑒定很重要！某些特殊細(xì)菌的直接鏡檢報(bào)告對(duì)于臨床疾病具有診斷意義！如：抗酸染色、分泌物涂片查革蘭陰性雙球菌。血液、腦脊液的陽(yáng)性培養(yǎng)需要即時(shí)報(bào)告細(xì)菌的革蘭染色結(jié)果，根據(jù)細(xì)菌的染色性、排列方式、形態(tài)可以初步區(qū)分種類。菌落的肉眼觀察觀察要點(diǎn)：菌落大小、顏色、溶血性、形態(tài)、表面光澤、濕潤(rùn)或干燥等。菌落大?。耗c球菌、鏈球菌菌落小、腸桿菌科細(xì)菌菌落大（與培養(yǎng)時(shí)間、營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)亦有關(guān)系）；顏色：PAE產(chǎn)綠色素、粘質(zhì)沙雷菌菌落紅色、SAU菌落金黃色；溶血性：α、β、γ溶血；形態(tài)：圓形、凸起、扁平、不規(guī)則鋸齒形；表面光澤：PAE具有特殊的金屬光澤；濕潤(rùn)/干燥：BCA菌落干燥易破碎、革蘭陰性桿菌菌落濕潤(rùn)。

菌落形態(tài)大小與培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)短、培養(yǎng)基種類有關(guān)系；不同平板上相同的細(xì)菌具有不同的形態(tài)特征；不同的細(xì)菌在相同的平板上也可以菌落形態(tài)相似。細(xì)菌鑒定涂片鏡檢趨向性反應(yīng)實(shí)驗(yàn)根據(jù)不同種屬細(xì)菌選擇生化反應(yīng)根據(jù)主要的生化反應(yīng)結(jié)果判定細(xì)菌種類商品化的鑒定試劑條、細(xì)菌鑒定儀涂片鏡檢：初步判斷細(xì)菌革蘭染色陰、陽(yáng)性，球菌、桿菌、酵母菌等。革蘭陽(yáng)性

革蘭陰性影響因素：涂片過厚將使脫色不完全，酒精脫色時(shí)間過長(zhǎng)將導(dǎo)致過度脫色；染液儲(chǔ)存過久由于蒸發(fā)而影響濃度，特別是碘液久存或見光而形成碘酸，失去媒染作用；95%酒精如果密封不佳易揮發(fā)，失去脫色作用；細(xì)菌形態(tài)學(xué)檢查以對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)菌形態(tài)最為典型，菌齡過長(zhǎng)易致陰性。趨向性生化反應(yīng)氧化酶實(shí)驗(yàn)觸酶實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性：紫紅色陰性：無(wú)色陽(yáng)性：大量氣泡陰性或弱陽(yáng)性：無(wú)或少量氣泡大部分非發(fā)酵屬細(xì)菌、弧菌屬腸桿菌屬、不動(dòng)桿菌屬、嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌葡萄球菌屬鏈球菌屬、腸球菌屬氧化酶觸酶（+）（-）（+）（-）有關(guān)抗菌藥物敏感性實(shí)驗(yàn)的方法學(xué)！常用方法：K-B法、微量稀釋法、E-test法；操作步驟注意事項(xiàng)紙片擴(kuò)散法（Kirby-Bauer法）原理：將含有定量抗菌藥物的紙片貼在已接種測(cè)試菌的瓊脂平板上，紙片中所含的藥物吸收瓊脂中水分溶解后不斷向紙片周圍擴(kuò)散形成遞減的梯度濃度，在紙片周圍抑菌濃度范圍內(nèi)測(cè)試菌的生長(zhǎng)被抑制，從而形成無(wú)菌生長(zhǎng)的透明圈即為抑菌圈。抑菌圈的大小反映測(cè)試菌對(duì)測(cè)定藥物的敏感程度，并與該藥對(duì)測(cè)試菌的MIC呈負(fù)相關(guān)。操作方法：

1.將在約56℃恒溫的無(wú)菌M-H瓊脂傾注直徑為90mm

的平板，其厚度4mm。

2.無(wú)菌挑取孵育16～24h的血平板上4~5個(gè)菌落。3.置于無(wú)菌生理鹽水中，校正其濁度于McFarland

No0.5管。4.用無(wú)菌棉簽浸入細(xì)菌懸液中，將拭子在試管上壁輕輕擠壓以擠去過多的菌液。棉簽在三個(gè)方向均勻抹瓊脂表面（每次轉(zhuǎn)60℃）使菌液均勻分布，最后沿平板內(nèi)緣涂抹一周。5.蓋上平板的蓋子，放置培養(yǎng)箱內(nèi)孵育，放置3~10分鐘后貼上標(biāo)準(zhǔn)抗生素紙片。6.根據(jù)選擇的菌株挑選相應(yīng)的抗菌紙片。◆腸桿菌科：氨芐西林、阿米卡星、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢噻肟、環(huán)丙沙星、亞胺培南、氨曲南、慶大霉素；◆銅綠假單胞菌：頭孢他啶、慶大霉素、哌拉西林、阿米卡星、環(huán)丙沙星、頭孢吡肟、亞胺培南；◆葡萄球菌屬：頭孢西丁、青霉素、紅霉素、萬(wàn)古霉素、環(huán)丙沙星、慶大霉素；◆腸球菌屬：青霉素、萬(wàn)古霉素、四環(huán)素、高濃度慶大霉素、環(huán)丙沙星、氨芐西林；◆不動(dòng)桿菌屬：頭孢他啶、亞胺培南、阿米卡星、頭孢吡肟、米諾環(huán)素；◆洋蔥伯克霍德菌：頭孢他啶、米諾環(huán)素、甲氧芐啶/磺胺異噁唑；◆嗜麥芽窄食單胞菌：甲氧芐啶/磺胺異噁唑、左氧氟沙星、米諾環(huán)素。7.用無(wú)菌鑷子或紙片分配器將抗菌紙片粘貼于M-H瓊脂的表面，一旦紙片貼上，不能移動(dòng)；各抗菌紙片中心距離應(yīng)大于24mm，紙片距平板內(nèi)緣應(yīng)大于15mm。8.經(jīng)過35℃16～24h孵育。9.取抑菌環(huán)直徑，根據(jù)CLSI標(biāo)準(zhǔn)，報(bào)告細(xì)菌對(duì)該抗生素敏感(S)、耐藥(R)、中介(I)。

E-TEST原理：

E試條是一條5mm×50mm無(wú)孔試劑載體，一面固定有一系列預(yù)先制備的濃度呈連續(xù)指數(shù)增長(zhǎng)稀釋抗菌藥物，另一面有讀數(shù)和判別的刻度?？咕幬锏奶荻瓤筛采w有20個(gè)MIC對(duì)倍稀釋濃度的寬度范圍。將E試條放在細(xì)菌接種過的瓊脂平板上，經(jīng)孵育過夜，圍繞試條明顯可見橢圓形抑菌圈，圈的邊緣與試條交點(diǎn)的刻度濃度即為抗菌藥物抑制細(xì)菌的最小抑菌濃度，對(duì)照CLSI標(biāo)準(zhǔn)判斷其敏感、耐藥、中介。操作方法：1.挑取16～20h的菌落2.用無(wú)菌生理鹽水制備成0.5麥?zhǔn)媳葷峁軡岫鹊木骸?.用無(wú)菌棉簽浸入細(xì)菌懸液中，將拭子在試管上壁輕輕擠壓以擠去過多的菌液。棉簽在三個(gè)方向平均涂抹瓊脂表面（每次轉(zhuǎn)60℃）使菌液均勻分布，最后沿平板內(nèi)緣涂抹一周。4.用鑷子將E-TEST試條的抗菌藥物的一面貼向瓊脂表面，有刻度的一面向外，直徑140mm的平板可放置6條，9mm平板只能放置1～2試條。5.孵育，置平板于35℃孵育16～24h。6.孵育后形成一橢圓形抑菌圈，抑菌圈和試條的相交處的刻度即為抗菌藥物對(duì)該菌的最低抑菌濃度(MIC)。如何來(lái)確定常規(guī)報(bào)告的抗菌藥物種類？根據(jù)采用的方法學(xué)不同：K-B法、MIC法；

★不是所有種類細(xì)菌都能采用K-B法報(bào)告藥敏結(jié)果；★不是所有細(xì)菌都有明確的折點(diǎn)判斷標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)自己醫(yī)院內(nèi)使用的抗菌藥物種類；由醫(yī)院醫(yī)務(wù)處、藥學(xué)部、檢驗(yàn)科微生物室共同商討制定。結(jié)果報(bào)告的解釋敏感是指分離菌株能被使用推薦劑量在感染部位通?？蛇_(dá)到的抗菌藥物濃度所抑制。中介包括這些菌株，其抗菌藥物MIC接近于血液和組織中通?？蛇_(dá)到的水平，而抗微生物藥治療的反應(yīng)率可能低于敏感株?！爸薪椤狈诸愐馕吨幬镌谏頋饧牟课痪哂信R床效力(如尿液中的喹諾酮類和β-內(nèi)酰胺類)或者可用高于正常劑量的藥物進(jìn)行治療(如β-內(nèi)酰胺類)。結(jié)果報(bào)告的解釋耐藥是指分離菌株不被常規(guī)劑量用藥通常可達(dá)到的藥物濃度所抑制，和/或證明抑菌環(huán)直徑落在可存在某些特定的微生物耐藥機(jī)制范圍(如β-內(nèi)酰胺酶)，并且治療研究顯示藥物對(duì)分離菌株的臨床療效不可靠。關(guān)于藥敏報(bào)告！不是所有的抗生素都需要做藥敏實(shí)驗(yàn)，可以根據(jù)已報(bào)告的某種藥物進(jìn)行推定；3天之內(nèi)的同患者同部位重復(fù)分離株可以不用重復(fù)進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，但除這期間外的重復(fù)分離株必須再次測(cè)定。

舉例：肺炎鏈球菌對(duì)苯唑西林的抑菌環(huán)≥20mm的菌株對(duì)青霉素亦敏感(MIC≤0.06μg/ml)，并經(jīng)臨床證實(shí)可以認(rèn)為對(duì)氨芐西林、阿莫西林、阿莫西林/克拉維酸、氨芐西林/舒巴坦、頭孢克洛、頭孢地尼、頭孢吡肟、頭孢他美、頭孢克肟、頭孢噻肟、頭孢丙烯、頭孢布烯、頭孢曲松、頭孢呋辛、頭孢泊肟、頭孢唑肟、厄他培南、亞胺培南、氯碳頭孢和美洛培南敏感，所以不需要再測(cè)定這些藥。隨著用Ⅲ代頭孢菌素治療時(shí)間的延長(zhǎng)，腸桿菌屬、枸櫞酸桿菌屬和沙雷菌屬可發(fā)展為耐藥。最初分離的敏感菌株在開始治療3~4天內(nèi)可變?yōu)槟退?，因此?duì)重復(fù)分離菌株應(yīng)重新進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。在長(zhǎng)期用抗生素治療過程中銅綠假單胞菌可能發(fā)生耐藥，因此，初次分離的敏感菌株在治療3－4天后可能發(fā)生耐藥。測(cè)試重復(fù)分離菌株可能是必要的。已經(jīng)培養(yǎng)陽(yáng)性的患者為何還要定期做重復(fù)的培養(yǎng)由銅綠假單胞菌引起的嚴(yán)重感染，青霉素類藥物若敏感則需提高治療劑量。對(duì)這種感染，用單一抗菌藥物常致臨床治療失敗，應(yīng)考慮增加體外對(duì)銅綠假單胞菌有抗菌活性的第2種藥物（如氟喹諾酮類、氨基糖苷類）長(zhǎng)期應(yīng)用喹諾酮類治療過程中，葡萄球菌屬可發(fā)展其耐藥性。因此，最初敏感的分離株在開始治療3-4天后可以變?yōu)槟退帲瑧?yīng)對(duì)重復(fù)分離株測(cè)試藥敏試驗(yàn)。已經(jīng)培養(yǎng)陽(yáng)性的患者為何還要定期做重復(fù)的培養(yǎng)正確閱讀紙片法結(jié)果★完全抑制的抑菌圈直徑，包括紙片的直徑不反光的黑色背景、反射光下閱讀結(jié)果；★抑菌圈的界限應(yīng)該是以肉眼觀察沒有明顯的可見細(xì)菌生長(zhǎng)區(qū)域；★在抑菌圈邊緣微弱生長(zhǎng)的、僅能在放大鏡下才能觀察到的細(xì)小菌落應(yīng)忽略。正確閱讀抑菌圈內(nèi)的“霾”現(xiàn)象★變形桿菌(遷移生長(zhǎng))以及磺胺類藥物的紙片法藥敏忽略薄紗樣蔓延生長(zhǎng)，微弱生長(zhǎng)（20%或更少）；★克林霉素對(duì)葡萄球菌的抑菌圈內(nèi)如有薄霧狀菌苔應(yīng)報(bào)告細(xì)菌對(duì)克林霉素耐藥,不管其是否顯示“D”抑菌圈；★需在透射光（Transmittedlight）下閱讀萬(wàn)古霉素、利奈唑胺和苯唑西林的抑菌圈，遇不敏感的結(jié)果需用稀釋法測(cè)定MIC法確證。需要檢測(cè)MIC的細(xì)菌/藥物肺炎鏈球菌

苯唑西林直徑≤19mm,需要明確受試菌對(duì)青霉素的敏感性，必須做青霉素的E-試驗(yàn)革蘭陽(yáng)性球菌

萬(wàn)古霉素不敏感時(shí)（中介或耐藥），必須測(cè)萬(wàn)古霉素的MIC確認(rèn)受試菌對(duì)萬(wàn)古霉素的敏感性（包括替考拉寧、利奈唑胺等）草綠色鏈球菌

對(duì)青霉素、氨芐西林紙片法藥敏結(jié)果不可靠，必須測(cè)MIC藥敏試驗(yàn)中應(yīng)注意的問題紙片擴(kuò)散法★培養(yǎng)基標(biāo)準(zhǔn)化：pH、離子濃度、厚度、硬度、表面濕度★特殊培養(yǎng)基：HTM、5%羊血M-H★孵育條件：時(shí)間、溫度、氣體★接種菌量：0.5Mcfarland（麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)管的保存及比濁儀的檢定）★藥敏紙片的效價(jià)、質(zhì)量、保存、使用★結(jié)果判讀：質(zhì)控菌株保存（低溫保存，避免反復(fù)傳代）、卡尺檢定★特殊耐藥細(xì)菌的檢測(cè)應(yīng)該定期的進(jìn)行臨床聯(lián)系！正確的結(jié)果來(lái)源于正確的標(biāo)本采集、轉(zhuǎn)運(yùn)、保存；一些特殊檢驗(yàn)標(biāo)本亦需床邊采集。主動(dòng)解釋適時(shí)更新的藥敏判斷內(nèi)容；醫(yī)院定期組織對(duì)新進(jìn)臨床醫(yī)技人員進(jìn)行標(biāo)本采集知識(shí)的培訓(xùn)；有必要向臨床解釋CLSI文件抗生素選擇中“和/或”字的意