酵母核糖核酸的提取及測定植物098原碩0901080808摘要：用濃鹽法提取酵母RNA，經(jīng)過多步分離提純，在現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)條件下，得到樣本RNA含量=67.5%，RNA提取率=1.2%關(guān)鍵字：酵母，濃鹽法，RNA含量，提取及測定研究背景及目的：RNA作為細(xì)胞中參與基因表達(dá)和蛋白質(zhì)合成的重要物質(zhì)，在平時(shí)學(xué)習(xí)中多有涉及，本實(shí)驗(yàn)通過從酵母中提取RNA，掌握提制RNA的方法并掌握其測定手段，鞏固離心機(jī)和紫外分光光度計(jì)的使用。研究依據(jù)及原理：酵母作為工業(yè)上大量生產(chǎn)核酸的最為理想的微生物，因?yàn)榻湍负怂嶂兄饕荝NA（2.67~10.0%），DNA很少（0.03~0.516%），菌體容易收集，RNA也易于分離。此外，抽提后的菌體蛋白質(zhì)，也具有很高的利用價(jià)值。RNA提取過程是先使RNA從細(xì)胞中釋放，并使它和蛋白質(zhì)分離，然后將菌體除去，再根據(jù)核酸在等電點(diǎn)溶解度最小的性質(zhì)，將pH調(diào)到2.0~2.5使RNA沉淀，進(jìn)行離心收集。提取RNA的方法很多，在工業(yè)生產(chǎn)上常用的是稀堿性和濃鹽法。本實(shí)驗(yàn)采取濃鹽法（10%NaCl）核酸不論是DNA還是RNA，都是由核苷酸組成的多聚核苷酸化合物，而核苷酸是由糖，堿基和磷酸構(gòu)成。要測定生物體內(nèi)核酸的含量或者測定提取出來的核酸含量，只需要測定組成核苷酸的一種成分，如磷，糖或堿基，便可計(jì)算出核糖的含量，因?yàn)楹怂惴肿又羞@三個(gè)組份是以等分子比例存在的，即每一個(gè)嘌呤或嘧啶分子都與一分子戊糖及一分子磷酸相連接的，所以只要測出其中任何一組分的含量即可求出核糖的含量。本實(shí)驗(yàn)采用紫外吸收法測定核糖核酸含量，因?yàn)楹怂岬慕M成成分嘌呤及嘧啶堿基具有強(qiáng)烈的紫外吸收，最大吸收在260mm處，利用此特性可以對核酸進(jìn)行定量測定。實(shí)驗(yàn)材料與方法：材料：干酵母（安琪牌）灰藍(lán)色pH試紙和黃色pH試紙?jiān)噭海?）10%NaCl（2）6NHCl（3）95%乙醇（分析純）（4）5~6%的氨水（5）RNA沉淀劑取0.5克鉬酸銨，加水193ml，加7ml70%過氯酸，總體積200ml。（70%過氯酸即高氯酸，原液濃度即是70%）。儀器：量筒：50ml；具塞試管：15ml×2三角瓶：100ml；容量瓶：25ml×1,50ml×2燒杯：50ml×3表面皿：6cm×1滴管，玻棒，移液器，塑料碗烘箱離心機(jī)托盤天平，分析天平勻漿器紫外分光光度計(jì)（Rayleigh，UV-9600）實(shí)驗(yàn)方法：提取：稱取7g酵母，研缽中研磨成粉末，倒入三角瓶中，然后量取50ml10%NaCl溶液，倒入三角瓶，是酵母粉充分徹底懸浮，之后小心放入沸水浴中，浸提半小時(shí)。分離：將上述提取液取出，于冰浴中徹底冷卻，轉(zhuǎn)入離心管，以3500r/min離心30min。使提取液及菌體殘?jiān)确蛛x。沉淀RNA：將離心得到的上清液，小心傾倒于50ml小燒杯中，并置于冰浴中冷卻，待溶液冷卻至10℃以下后，于冰浴中在攪拌下（注意不要過分劇烈）小心用6MHCl調(diào)節(jié)pH至2.0~2.5（用灰藍(lán)色pH試紙），調(diào)好后繼續(xù)于冰水中放置10min。洗滌純化：將上述懸濁液小心轉(zhuǎn)入離心管，以3000r/min離心10min，得到RNA沉淀。小心傾去上清液，直接與離心管中用95%乙醇洗滌RNA沉淀兩次，每次用15ml乙醇，充分?jǐn)嚢柘礈?，然后?500r/min離心6min。干燥：用牛角勺仔細(xì)將洗滌后的RNA沉淀從離心管內(nèi)挖出涂于事先將邊緣折起成框的稱量紙上（預(yù)先用分析天平稱重并記錄數(shù)據(jù)），涂布均勻后，小心置于80℃烘箱內(nèi)5min左右，使沉淀充分干燥。將干燥后的RNA制品連同稱量紙一起準(zhǔn)確稱重，而后小心將RNA制品的大部分轉(zhuǎn)移至勻漿器中，將稱量紙和殘余RNA制品再次稱重，記錄下所有數(shù)據(jù)。含量測定（紫外分光光度法）：采用比消光系數(shù)法，比消光系數(shù)本實(shí)驗(yàn)中給定A260=0.022。測定步驟：將第5步中得到的溶液,轉(zhuǎn)入小燒杯中，用5%氨水小心調(diào)pH至7.0（用黃色pH試紙），最后轉(zhuǎn)入25ml容量瓶，用蒸餾水定容。取兩支試管，按下表操作：管號RNA液H2O沉淀劑A5ml5ml——B5ml——5ml搖勻，冰浴20min，轉(zhuǎn)入離心管3500r/min離心10min，小心取上清液，各取0.5ml至50ml容量瓶，蒸餾水定容，其中一個(gè)做標(biāo)準(zhǔn)空白液，在紫外分光光度計(jì)上測定OD260值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果及計(jì)算：原始數(shù)據(jù)：稱取酵母量（樣品重）W=7g空白稱量紙重W1=0.6048g總制品+紙重W2=0.7282g殘余制品+紙重W3=0.6198g比消光系數(shù)A260=0.022測定消光值OD260=0.322透光度T=47.6%推演數(shù)據(jù)：總制品重：G1=0.1234g定量樣品重：G2=0.1084g結(jié)果計(jì)算：RNA含量（%）=E260AV：被測樣品體積D：樣品測定時(shí)的稀釋倍數(shù)RNA提取率（%）=RNA含量×G1W結(jié)果分析：本實(shí)驗(yàn)使用濃鹽法和紫外分光光度法提取和測定了酵母的核糖核酸含量。實(shí)驗(yàn)中，有如下幾處可能產(chǎn)生誤差，1、研磨時(shí)的充分程度，研磨的充分程度的不同，將直接影響最后所能提取到的RNA含量的多少。2、本實(shí)驗(yàn)過程中，多次涉及到樣品轉(zhuǎn)移、離心、洗滌過程中，將不可避免的造成樣品的損失，直接造成最終RNA提取率的下降。3、實(shí)驗(yàn)操作過程中，實(shí)驗(yàn)人員并未佩戴手套，人體附帶的RNase一類的酶可能會造成一定量的RNA分解。4、烘干后的RNA樣品很輕，在稱量、轉(zhuǎn)移過程中很容易造成損失。綜上所述，本實(shí)驗(yàn)中一定未能提取出酵母的全部RNA，實(shí)驗(yàn)過程中必然造成了樣品一定程度上的損失，參考酵母RNA含量（2.67~10.0%），以及在A260/A280=1.983時(shí)，90g濕酵母（相當(dāng)于20g干酵母）可提取1gRNA（選自：李志東邱峰張洪林，《影響濃鹽法提取啤酒酵母RNA的工藝參數(shù)研究》，《化工技術(shù)與開發(fā)》2007年第36卷第2期，12頁36卷），考慮到本實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)條件及上面提到的誤差因素，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果在RNA含量和RNA提取率上都基本讓人滿意。參考文獻(xiàn)：李良秋黃曉蘭，《高效液相色譜法測定酵母RNA中四種生物堿基的含量》，第二屆全國發(fā)酵工程學(xué)術(shù)討論會第二屆全國發(fā)酵工程學(xué)術(shù)討論會論文集，1998年徐希柱，《啤酒酵母中RNA、β-（1，3）-D-葡聚糖和蛋白質(zhì)的提取及應(yīng)用研究》，《山東農(nóng)業(yè)大學(xué)》2007年田寶勇趙星潔，《啤酒酵母RNA降解產(chǎn)物5′-核苷酸的高效液相色譜分析》，《釀酒科技》,2008年第3期李珊吳振強(qiáng)，《鹽法提取啤酒廢酵母RNA的研究》，《釀酒科技》2005年第7期朱俊東黃國榮糜漫天郎海濱，《啤酒酵母中提取核糖核酸的研究》，《食品科學(xué)》1602006,Vol.27,No.02廖鮮艷李永仙等，《啤酒酵母胞內(nèi)RNA提取的研究》，《釀酒》2002年第29卷第2期李志東邱峰張洪林，《影響濃鹽法提取啤酒酵母RNA的工藝參數(shù)研究》，《化工技術(shù)與開發(fā)》2007年第36卷第2期曹成喜等，《生物化學(xué)儀器分析基礎(chǔ)》，2008，化學(xué)工業(yè)出版社孫培龍吳石金，《生物化學(xué)技術(shù)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)》，2008，化學(xué)工業(yè)出版社張龍翔張庭芳李玲媛，《生化試驗(yàn)方法和技術(shù)》，1997，高等教育出版社思考題：RNA中的嘌呤堿基和嘧啶堿基在不同pH條件下異構(gòu)情況不同，對紫外光的吸收值不同，摩爾消光系數(shù)會隨之改變。所以應(yīng)固定pH值；pH不固定會影響測定結(jié)果。因?yàn)閜H不同的條件下，OD值也會隨之改變，而實(shí)驗(yàn)中所給的比消光系數(shù)是在一定pH值下給定的。所以pH值不固定會影響測定結(jié)果。1）加鉬酸銨—過氯酸沉淀劑是為了沉淀RNA，然后用得到的上清液做空白對照，以減少定量樣品重的蛋白質(zhì)、糖類等物質(zhì)對RNA含量測定的干擾；2）由朗博—比爾定律A=εbc，當(dāng)吸光度在0.2~0.8時(shí)，測量誤差最小，本實(shí)驗(yàn)中ε、b都已固定，只能改變濃度c，是A在上述范圍內(nèi)，所以要稀釋。1）總體策略：保持物質(zhì)活性，結(jié)構(gòu)完整，純化到所需濃度，能夠大量提純（量產(chǎn)）；2）分離純化生命大分子時(shí)要注意：保持所提取物質(zhì)活性；抑制或避免接觸所能分解被提純物質(zhì)的酶，以免物質(zhì)被酶分解；反應(yīng)條件應(yīng)溫和，避免能破壞生命大分子的因素。實(shí)驗(yàn)小結(jié)：酵母作為工業(yè)上大量生產(chǎn)核酸的最為理想的微生物，因?yàn)榻湍负怂嶂兄饕荝NA，DNA很少，菌體容易收集，RNA也易于分離。因而本實(shí)驗(yàn)使用濃鹽法和紫外分光光度法提取和測定了酵母的核糖核酸含量。實(shí)驗(yàn)過程中，通過濃鹽法提取出樣品酵母中的RNA，經(jīng)過多次分離提純，最后用紫外分光光度發(fā)，通過吸光率，測定了樣品中的RNA含量。計(jì)算出RNA提取率。實(shí)驗(yàn)中從在幾處誤差，使得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)在現(xiàn)有條件下不可避免偏低，但參考酵母RNA標(biāo)準(zhǔn)范圍（2.67~1