蓮子心生物堿類成分分離鑒定及其抗心律失常作用初步研究

蓮子心是睡蓮科植物的成熟種子。蓮子心為常用中藥,傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為其具有清心安神、交通心腎、澀精止血之功效。現(xiàn)代研究表明,蓮子心治療心血管疾病的有效部位為生物堿類成分。其中甲基蓮心堿、異蓮心堿、蓮心堿等3種雙芐基異喹啉類生物堿具有顯著的抗心律失常、抗心肌缺血、降壓等藥理活性,已成為現(xiàn)代中醫(yī)藥研究的熱點(diǎn)之一。1材料表面1.1動(dòng)物雄性SD大鼠,體重200～250g,由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供,合格證號(hào):SCXK(京)2006-0006。1.2試劑及儀器地奧心血康膠囊(批號(hào)0203073),四川成都地奧集團(tuán);層析用硅膠,青島海洋化工有限公司生產(chǎn);除甲醇為Fisher公司產(chǎn),其余所用試劑均為分析純,北京化工廠生產(chǎn)。蓮子心藥材于2007年11月購自湖南湘潭,經(jīng)中國中醫(yī)科學(xué)院中藥所生藥室何希榮主管技師鑒定。蓮子心總生物堿溶液:取總生物堿提取物,加水及少量吐溫80溶解,分別制成5.0,10.0,20.0mg·mL-1的溶液。1.3紅外分光光度儀質(zhì)譜儀:VG-250氣質(zhì)聯(lián)用儀,(英國TRACE-EI-MS);NEXUS-FTIR型紅外分光光度儀(Nicolet公司生產(chǎn));HP1100型高效液相色譜儀;AL-400核磁共振波譜儀(JEOL公司生產(chǎn))。BiopacMP-100生理多用儀,美國;HB-140B型動(dòng)物呼吸機(jī)(浙江醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)儀器廠)。2方法和結(jié)果2.1蓮子心總原則取蓮子心粉末50kg,加入含1‰鹽酸的80%乙醇溶液500L,浸泡1h,攪拌1h,第2次加入400L溶劑,攪拌1h,第3次同樣加入400L溶劑,攪拌30min,過濾,回收乙醇至無醇味,離心,取上清液,加2mol·L-1NaOH溶液調(diào)pH值8～9,離心,取沉淀,干燥,得到蓮子心總生物堿約500g。2.2蓮子心總氨基酸的分離和結(jié)構(gòu)試驗(yàn)2.2.1化合物的合成取上述干燥至恒重的總生物堿100g,進(jìn)行硅膠柱層析,三氯甲烷-二乙胺梯度洗脫,99∶1梯度下得到化合物Ⅰ,97∶3梯度下得到化合物Ⅱ,95∶5梯度下得到化合物Ⅲ。取化合物Ⅰ粗品1g溶于1%鹽酸,三氯甲烷反復(fù)萃取,取酸水層用氨水調(diào)節(jié)pH值至8～9,三氯甲烷萃取,回收三氯甲烷,殘?jiān)脽o水乙醇反復(fù)重結(jié)晶得到淡黃色無定形粉末:化合物Ⅰ(180mg)。取化合物Ⅱ粗品500mg,溶于熱的無水乙醇,加入稍過量的4%鹽酸,放置析晶。將結(jié)晶溶于3%氫氧化鈉溶液,加入氯化銨直到析出乳白色沉淀為止,用三氯甲烷反復(fù)提取,蒸餾水洗滌,無水硫酸鈉脫水,得松散的黃白色無定形粉末:化合物Ⅱ(98mg)。取化合物Ⅲ粗品1g,溶于適量的無水乙醇中,微熱溶解,在冰水冷卻下,滴加稍過量的70%高氯酸,使溶液呈酸性,置冰箱過夜,析出黃色顆粒狀結(jié)晶,過濾,用冷卻無水乙醇洗滌得白色顆粒狀結(jié)晶:化合物Ⅲ的高氯酸鹽。取該高氯酸鹽溶于3%NaOH溶液中,加入適量固體氯化銨,直到析出乳白色沉淀為止,依次用三氯甲烷、水提取洗滌,無水硫酸鈉干燥,得松散的白色無定形粉末:化合物Ⅲ(100mg)。2.2.2cnmr譜圖譜分析化合物Ⅰ:淡黃色無定形粉末,mp59～61℃,改良碘化鉍鉀顯色為陽性,UV(MeOH)λmaxnm:283.0;IR(KBr,cm-1):3400(OH),2937(C-H),2835、2792(O-CH3或N-CH3),1612,1510(苯環(huán)骨架振動(dòng)),1464(δasCH3),1248,1227,1018;EI-MS顯示基峰為206,主要碎片離子有m/z625(M+1)。1HNMR:δ3.64(1H,m,1-H),δ2.50(3H,s,2-NCH3),δ2.75(1H,m,3-H),δ3.16(1H,m,3-H),δ2.57(1H,m,4-H),δ2.81(1H,m,4-H),δ6.50(1H,s,5-H),δ3.71(3H,s,6-OCH3),δ6.62(1H,s,8-H),δ2.67(1H,m,9-H),δ3.09(1H,m,9-H),δ6.89(1H,d,J=8.6,11-H),δ6.68(1H,d,J=8.7,12-H),δ6.68(1H,d,J=8.7,14-H),δ6.89(1H,d,J=8.6,15-H),δ3.51(3H,s,13-OCH3),δ3.64(1H,m,1′-H),δ2.47(3H,s,2′-NCH3),δ2.75(1H,m,3′-H),δ3.16(1H,m,3′-H),δ2.63(1H,m,4′-H),δ2.81(1H,m,4′-H),δ5.98(1H,s,5-H),δ3.78(3H,s,6′-OCH3),δ6.36(1H,s,8′-H),δ2.78(1H,m,9′-H),δ3.00(1H,dd,J=5.3,13.9,9′-H),δ6.53(1H,d,j=1.9,11′-H),δ6.84(1H,d,J=8.2,14′-H),δ6.69(1H,dd,J=2.0,7.7,15′-H)。13CNMR中,δ64.35(C-1),δ42.57(C2-NCH3),δ46.54(C-3),δ24.99(C-4),δ55.42(C6-OCH3),δ40.56(C-9),δ55.06(C13-OCH3),δ64.74(C-1′),δ42.31(C2′-NCH3),δ47.11(C-3′),δ25.99(C-4′),δ55.82(C6′-OCH3),δ55.68(C7′-OCH3),δ39.82(C-9′)光譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道相一致。故確定為甲基蓮心堿(Neferine)?；衔铫?白色無定形粉末,mp70～72℃,改良碘化鉍鉀顯色為陽性,UV(MeOH)λmaxnm:284.0:IR(KBr,cm-1):3400(OH),2937,1612,1512(苯環(huán)骨架振動(dòng)):1248,1120(-CO);EI-MS顯示基峰為192,主要碎片離子有m/z609(M-1);1HNMR和13CNMR(CDCL3):1HNMR中δ3.70(1H,t,J=6.2,1-H),δ2.41(3H,S,2-NCH3),δ2.82(1H,m,3-H),δ3.14(1H,m,3-H),δ2.52(1H,m,4-H),δ2.74(1H,m,4-H),δ6.30(1H,S,5-H),δ3.73(3H,S,6-OCH3),δ6.33(1H,S,8-H),δ2.78(1H,m,9-H),δ2.97(1H,dd,J=5.3,14.1,9-H),δ6.90(1H,d,J=8.6,11-H),δ6.70(1H,d,J=8.6,12-H),δ6.70(1H,d,J=8.6,14-H),δ6.90(1H,d,J=8.6,15-H),δ3.79(3H,S,13-OCH3),δ3.60(1H,t,J=5.8,1′-H),δ2.52(3H,S,2′-NCH3),δ2.69(1H,m,3′-H),δ3.12(1H,m,3′-H),δ2.66(1H,m,4′-H),δ2.87(1H,m,4′-H),δ6.46(1H,S,5′-H),δ3.81(3H,S,6′-OCH3),δ6.46(1H,S,8′-H),δ2.74(1H,m,9′-H),δ3.08(1H,m,9′-H),δ6.64(1H,S,11′-H),δ6.82(1H,d,J=8.2,14′-H),δ6.74(1H,dd,j=1.7,8.2,15′-H)。13CNMR中,δ63.95(C-1),δ42.09(G2-NCH3),δ46.05(C-3),δ24.75(C-4),δ54.74(C6-OCH3),δ40.10(C-9),δ55.39(C13-OCH3),δ64.13(C-1′),δ42.03(C2′-NCH3),δ46.84(C-3′),δ25.48(C-4′),δ55.54(C6′-OCH3),δ38.81(C-9′)以上光譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道相一致。故確定為異蓮心堿(ISOLiensinine)?；衔铫?白色無定形粉末,mp96～98℃,改良碘化鉍鉀顯色為附陛,UV(MeOH)λmaxnm:282.0;IR(KBr,cm-1)3420(OH),1612,1514(苯環(huán)骨架振動(dòng));1255,1119(-CO)。EI-MS顯示基峰為206,主要碎片離子有m/z609(M-1)+。1HNMR和13CNMR(CDCL3):1HNMR中δ3.68(1H,dd,j=2.7,9.9,1-H),δ2.51(3H,S,2-NCH3),δ2.98(1H,m,3-H),δ3.40(1H,m,3-H),δ2.64(1H,m,4-H),δ2.94(1H,m,4-H),δ5.73(1H,S,5-H),δ3.42(3H,S,6-OCH3),δ6.36(1H,S,8-H),δ3.13(1H,dd,J=2.7,9.9,9-H),δ3.64(1H,m,9-H),δ6.92(1H,d,J=8.3,11-H),δ6.75(1H,d,J=8.2,12-H),δ6.75(1H,d,J=8.2,14-H),δ6.92(1H,d,J=8.3,15-H),δ3.52(1H,dd,J=2.3,9.3,1′-H),δ2.54(3H,S,2′-NCH3),δ2.74(1H,m,3′-H),δ3.19(1H,m,3′-H),δ2.81(2H,m,4′-H),δ6.54(1H,S,5′-H),δ3.85(3H,S,6′-OCH3),δ3.82(3H,S,7′-OCH3),δ6.66(1H,S,8′-H),δ2.71(1H,m,9′-H),δ3.16(1n,m,9′-H),δ6.75(1H,d,J=2.0,11′-H),δ6.72(1H,d,J=8.1,14′-H),δ6.41(1H,dd,J=1.9,8.2,15′-H)。13CNMR中δ64.54(C-1),δ42.42(C2-NCH3),δ44.45(C-3),δ21.98(C-4),δ55.33(C6-OCH3),δ42.15(C-9),δ65.11(C-1′),δ40.51(C2′-NCH3),δ47.60(C-3′),δ26.20(C-4′),δ55.88(C6′-OCH3),δ55.71(C7′-OCH3),δ39.71(C-9′)以上光譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道相一致。故確定為蓮心堿(Liensinine)。2.3蓮花心總生物的抗結(jié)動(dòng)脈損傷的初步探討2.3.1各組大鼠灌胃給藥劑量ld5040只大鼠,隨機(jī)分為5組:模型對(duì)照組;蓮子心總生物堿溶液大(100mg/kg)、中(50mg/kg)、小(25mg/kg)劑量組;地奧心血康膠囊(地奧)270mg/kg組;各組預(yù)防灌胃給藥7d,每天1次;第8天進(jìn)行實(shí)驗(yàn),于實(shí)驗(yàn)前1h灌胃給藥1次。2.3.2動(dòng)脈插管及導(dǎo)心電圖檢測(cè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物用戊巴比妥鈉麻醉(30mg·kg-1iv)。氣管切開,接人工呼吸機(jī)進(jìn)行人工呼吸。呼吸頻率45～50次/分。暴露左頸總動(dòng)脈,插動(dòng)脈插管以監(jiān)測(cè)血壓(BP)。于胸骨左緣3～4肋間,打開胸腔及心包膜,暴露心臟;在肺動(dòng)脈圓錐與左心耳下緣之間經(jīng)左冠狀動(dòng)脈下淺層心肌穿一絲線,線的兩端穿過一條直徑2mm的聚乙烯塑料管,其末端用一小動(dòng)脈夾固定。通過打開和夾緊動(dòng)脈夾造成冠狀動(dòng)脈的阻斷與再通,阻斷30min,再通120min。連續(xù)記錄冠狀動(dòng)脈結(jié)扎前后及再通后Ⅱ?qū)碾妶D。觀察是否有心律失常發(fā)生、心律失常出現(xiàn)的時(shí)間及持續(xù)時(shí)間。2.3.3結(jié)果蓮子心總生物堿大、中劑量組明顯延長室速發(fā)生時(shí)間,并降低室速的持續(xù)時(shí)間,與模型組相比,均有顯著性差異。結(jié)果見表1。3提取的總堿中甲基蓮心堿、異蓮心堿、蓮心堿含量對(duì)動(dòng)物心律失常的影響本試驗(yàn)使用的蓮子心采自湖南湘潭,依據(jù)《中國藥典》2005年版一部蓮子心項(xiàng)下的測(cè)定方法