基因工程GeneEngineering細(xì)胞工程教研室張光謀gmzhang@3029114(辦論

在生物進(jìn)化過程中，遺傳和變異是兩個重要的概念。

遺傳性賦予生物種的穩(wěn)定。

變異性賦予生物種的進(jìn)化。極端嗜熱菌：能生長在90℃以上的高溫環(huán)境，是生物界耐受高溫的冠軍。極端嗜鹽菌：生活在高鹽度環(huán)境中，鹽度可達(dá)25%，如死海和鹽湖中，它們通過其細(xì)胞膜上光驅(qū)動的質(zhì)子泵，產(chǎn)生質(zhì)子動力勢，合成ATP。極端嗜酸菌：能生活在pH值1以下的環(huán)境中，往往也是嗜高溫菌，生活在火山地區(qū)的酸性熱水中，能氧化硫，硫酸作為代謝產(chǎn)物排出體外。極端嗜堿菌：多數(shù)生活在鹽堿湖或堿湖、堿池中，生活環(huán)境pH值可達(dá)11.5以上，最適pH值8-10。自然發(fā)生的變異是非常緩慢的。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，人們開始學(xué)會干預(yù)生物的變異。20世紀(jì)70年代，基因工程學(xué)誕生：以重組DNA技術(shù)，短時間內(nèi)改造生物的遺傳特性。一、基因工程的誕生

1973年

現(xiàn)代分子生物學(xué)：

理論上的三大發(fā)現(xiàn)技術(shù)上的三大發(fā)明

1、理論上的三大發(fā)現(xiàn)

40年代，發(fā)現(xiàn)生物的遺傳物質(zhì)是DNA。

——明確了遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)問題

50年代，揭示了DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)和半保留復(fù)制機(jī)理。

——解決了基因的自我復(fù)制和傳遞的問題60年代，相繼提出“中心法則”和“操縱子學(xué)說”，成功破譯遺傳密碼。

——

闡明了遺傳信息的流向和表達(dá)問題科學(xué)發(fā)展歷程1953NewDiscovery2、技術(shù)上的三大發(fā)明

限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)

基因工程的可能性：理論上

困難：龐大的dsDNA，不能獲得單個的基因片段。1970年美國約翰·霍布金斯大學(xué)H.Smith偶然發(fā)現(xiàn):流感嗜血桿菌（Haemophilusinfluenzae）能迅速降解外源的噬菌體DNA，無細(xì)胞提取液可降解E.coliDNA，但不能降解自身DNA，即HindII酶

1972年Boyer實(shí)驗(yàn)室EcoRI5’…GAATTC…3’3’…CTTAAG…5’

DNA連接酶的發(fā)現(xiàn)

1967年，世界上有5個實(shí)驗(yàn)室?guī)缀跬瑫r發(fā)現(xiàn)了DNA連接酶。

DNA連接酶能夠參與DNA缺口的修復(fù)。

1970年，美國Khorana實(shí)驗(yàn)室，發(fā)現(xiàn)

T4DNA連接酶，具有更高的連接活性。

基因工程載體的發(fā)現(xiàn)

有了對DNA

切割與連接的工具酶，還不能完成

DNA體外重組的工作

大多數(shù)DNA片段不具備自我復(fù)制的能力，必須將DNA片段連接到一種特定的、具有自我復(fù)制能力的DNA分子上。

——載體（Vector）？

載體的研究先于限制性核酸內(nèi)切酶。

1946年，Lederberg

開始研究細(xì)菌的性因子——F因子

50和60年代，相繼發(fā)現(xiàn)其它質(zhì)粒，抗藥性因子（R因子）大腸桿菌素因子（CoE因子）

1973年，Cohen

將質(zhì)粒作為基因工程的載體使用。

1972年，美國斯坦福大學(xué)

P.Berg研究小組

使用限制性內(nèi)切酶EcoRI，在體外對猿猴病毒SV40和λDNA分別進(jìn)行酶切，然后再用T4DNA連接酶連接，獲得了雜種DNA分子?！谝淮纬晒?shí)現(xiàn)DNA體外重組

1973年，美國斯坦福大學(xué)S.cohen等人，也成功的進(jìn)行了另一個體外重組實(shí)驗(yàn)并實(shí)現(xiàn)了細(xì)菌間性狀的轉(zhuǎn)移?！蚬こ贪l(fā)展史上第一次實(shí)現(xiàn)重組體轉(zhuǎn)化成功的例子。（一）定義：

大多數(shù)西方國家對此都有一個精確的法律定義，（由于政府對之的法律約束），一般說來，將基因工程定義為：將在細(xì)胞外產(chǎn)生的核酸分子插入病毒,質(zhì)?；蚱渌d體系統(tǒng)中，再整合到那些本來不含該類物質(zhì)的宿主中，從而形成一種新的可連續(xù)繁殖的有機(jī)體。二、基因工程的定義及主要研究內(nèi)容強(qiáng)調(diào)

外源核酸分子(一般為DNA)在不同宿主中的繁殖；打破自然種的界限；將來自不相關(guān)物種的基因放入一個宿主中。通過體外DNA重組和轉(zhuǎn)基因等技術(shù)，有目的地改造生物種性，使現(xiàn)有的物種在較短時間內(nèi)趨于完善，創(chuàng)造出更符合人們需求的新的生物類型。定義：相關(guān)的名稱：

遺傳工程（Geneticengineering)

基因操作（Genemanipulation)

重組DNA技術(shù)（RecombinantDNAtechnique)

分子克?。∕olecularcloning)

基因克?。℅enecloning)

遺傳工程比基因工程有更廣泛的內(nèi)容，凡是人工改造生物遺傳性的技術(shù)如物理化學(xué)誘變、細(xì)胞融合、花粉培育、常規(guī)育種、有性雜交等，還包括基因工程在內(nèi)。遺傳工程包括基因工程。遺傳工程不等于基因工程。

重組DNA技術(shù)

基因工程的核心內(nèi)容。嚴(yán)格地說，基因工程除上述定義所闡明的內(nèi)容外，還包括體外DNA突變、體內(nèi)基因操作以及基因的化學(xué)合成等。

重組DNA技術(shù)不等于基因工程。

克?。–lone）

當(dāng)作名詞使用時，是指從一個共同祖先無性繁殖下來的一群遺傳上同一的DNA分子、細(xì)胞或個體所組成的特殊的生命群體。當(dāng)作動詞使用時，則是指從同一祖先產(chǎn)生這類同一的DNA分子群體、細(xì)胞群體或個體群體的過程。因此，基因工程也可稱為基因克隆或DNA分子克隆。

（三）基因工程的研究步驟1.從生物有機(jī)體復(fù)雜的基因組中，分離出帶有目的基因的DNA片段。2.在體外，將帶有目的基因的外源DNA片段連接到能夠自我復(fù)制并具有選擇標(biāo)記的載體分子上，形成重組DNA分子。3.將重組DNA分子轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞，并與之一起繁殖。4.從大量的細(xì)胞繁殖群體中，篩選出獲得了重組DNA分子的受體細(xì)胞類型。5.從這些篩選出的受體細(xì)胞克隆，提取出已經(jīng)得到擴(kuò)增的目的基因，供進(jìn)一步研究使用。6.將目的基因克隆到表達(dá)載體上，導(dǎo)入受體細(xì)胞，使之在新的遺傳背景下，產(chǎn)生出人類所需要的物質(zhì)。基因工程技術(shù)路線基因工程技術(shù)路線1、DNA片段的取得（目的基因的分離和制備）2、DNA片段和載體的連接——重組體DNA3、外源DNA片段引入受體細(xì)胞——基因克隆和基因文庫4、選擇基因（目的基因）5、目的基因表達(dá)切接轉(zhuǎn)選表達(dá)基因工程技術(shù)路線（四）基因工程的理論依據(jù)1.不同基因具有相同的物質(zhì)基礎(chǔ)基因是遺傳信息的基本單位從物質(zhì)結(jié)構(gòu)上看，基因是核酸分子

基因是作為遺傳物質(zhì)的核酸分子上的一段片段，可以是連續(xù)的，也可以是不連續(xù)的，可以是DNA也可以是RNA，可以存在于染色體上，也可存在于染色體之外（如質(zhì)粒、噬菌體等）

2.基因及其產(chǎn)物的共線性基因決定蛋白質(zhì)的序列組成共線性：一個基因的核苷酸序列與其產(chǎn)物的氨基酸序列一一對應(yīng)例如：由N個氨基酸組成的蛋白質(zhì)，其對應(yīng)的基因編碼區(qū)由3N個堿基組成。

在原核生物中，基因及其產(chǎn)物是共線性的。3.基因及其產(chǎn)物的非共線性

70年代，在真核生物中發(fā)現(xiàn)間斷基因（interruptedgene）間斷基因在真核生物中普遍存在，基因間存在著內(nèi)含子（intron

）內(nèi)含子指真核生物基因中不能翻譯成蛋白質(zhì)的DNA片段，但可被轉(zhuǎn)錄；當(dāng)兩側(cè)序列（外顯子）的轉(zhuǎn)錄RNA被剪接在一起時，就將內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄的RNA從整個轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中除去。外顯子（exon）是指能夠翻譯成蛋白質(zhì)的任一間斷的基因片段，一個基因可有多個外顯子。內(nèi)含子并不是一成不變的，具有相對性。對一個DNA片段來說，在某個基因中是內(nèi)含子，但在另一個基因中卻可作為外顯子。4.基因是可以切割的；5.基因是可以轉(zhuǎn)移的；6.遺傳密碼是通用的；7.基因可以通過復(fù)制把遺傳信息傳遞給下一代。（二）基因工程的研究內(nèi)容基因工程克隆載體的研究原核表達(dá)載體,克隆載體;動物病毒載體;高等動植物轉(zhuǎn)基因的表達(dá)載體和定位整合載體基因工程受體系統(tǒng)的研究原核生物:大腸桿菌,藍(lán)藻等。真核生物:酵母菌,衣藻等。植物用作基因工程受體的有愈傷組織、細(xì)胞和原生質(zhì)體；動物用作基因工程受體的有生殖細(xì)胞、胚細(xì)胞和癌細(xì)胞。目的基因的研究目的基因主要是具有優(yōu)良性狀的基因、致病基因和功能未知的基因。獲得途徑主要是構(gòu)建基因組文庫或cDNA文庫，從中篩選出特殊需要的基因。目前已經(jīng)獲得的目的基因大致分為3類：與醫(yī)藥相關(guān)的基因；抗病、蟲害和惡劣環(huán)境的基因；編碼特殊營養(yǎng)價值的蛋白或多肽的基因。關(guān)于基因組測序

1977年，全長5387bp的噬菌體φX174測序完成?！议_大規(guī)模基因組測序工作的序幕1990年，人類基因組計(jì)劃啟動美、英、德、法、日、中（1%）2000年6月，人類基因組工作草圖繪制成功

1992年，中國水稻基因組計(jì)劃

1994年，首次構(gòu)建水稻基因組BAC全庫。1997年，成功構(gòu)建高分辨率水稻基因組物理圖譜。2001年，水稻基因組工作草圖繪制完成?；蚬こ坦ぞ呙傅难芯肯拗菩院怂醿?nèi)切酶：切割連接酶：大腸桿菌DNA連接酶和T4DNA連