《PrincpleandTechnologyofGeneticEngineering》

《基因工程原理》1

第三章基因工程載體教學目的與要求：1）掌握基因工程常用載體特點2）掌握基因克隆的基本方法2

第一節(jié)載體的定義

3載體（Vector）是指在寄主細胞內(nèi)能自我復制，并能夠作為運輸載體將重組DNA分子轉移到寄主細胞的DNA分子。（ADNAmoleculethatiscapableofreplicationinahostorganism,andcanactasacarriermoleculefortheconstructionofrecombinantDNA.）基因克隆載體：能承載外源DNA帶入受體細胞，并在其中自我復制以維持和擴增外源DNA的一類DNA分子，又稱為DNA克隆載體?；虮磉_載體Requireinavector:

CloningsitesOriginofreplicationSelectablemarkerSafety載體應該具備記到主要條件，以pBR322為例進行說明：1克隆位點:在DNA分子合適的位置有1到多個克隆位點，可供外源DNA片段插入克隆載體DNA分子中。2復制起點：具有復制起點，外源DNA插入載體后，仍可由復制起點起始復制過程。3篩選標記基因：具有用于選擇克隆子的標記基因。4安全性：克隆載體必須是安全的，不應含有對受體細胞有害的基因，且不能轉入除受體細胞以外的其他生物細胞，尤其是人的細胞。pBR322為例說明負篩選法：首先用不含AP和TC的培養(yǎng)基，兩種都長，然后選取一些菌落，在含AP的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，不長的，說明有外源基因插入AP位點，到不含AP和TC的培養(yǎng)基的培養(yǎng)基上找到相應的點。第二節(jié)質(zhì)粒載體（Plasmidvectors）

6一、質(zhì)粒的定義質(zhì)粒（Plasmid）:一種存在于細菌、酵母等寄主細胞中染色體外的裸露雙鏈DNA分子（acircularDNAmolecules,foundinnature,inbacteriaandsomeyeasts.pDNA）。大小一般可從1千多個堿基到100多kb，多數(shù)在10kb左右?？截悢?shù)：一個寄主細胞中某種質(zhì)粒的數(shù)量與染色體數(shù)量之比。一般寄主細胞只有一套染色體。按照拷貝數(shù)的多少，可以將質(zhì)粒劃分為嚴緊型質(zhì)粒和松弛型質(zhì)粒。當拷貝數(shù)在1-10之間時，通常稱為嚴緊型質(zhì)粒。很多大質(zhì)粒是嚴緊型質(zhì)粒。當拷貝數(shù)多于10個時，通常稱為松弛型質(zhì)粒，小質(zhì)粒一般是松弛型質(zhì)粒。嚴緊型質(zhì)粒和松弛型質(zhì)粒之間沒有嚴格界限。某種質(zhì)粒對于某種寄主來說，拷貝數(shù)一般是一定的，拷貝數(shù)的存在是因為質(zhì)粒上存在cop基因，它可以指令寄主細胞合成阻遏物，當質(zhì)粒復制到一定拷貝數(shù)后，阻遏物也達到一定量，就阻遏質(zhì)粒進一步復制。NumberofCopies：一個寄主細胞中某種質(zhì)粒的數(shù)量與染色體數(shù)目的比值。Basedonthenumberofcopiesoftheplasmidfoundinthehostcell:lowcopynumberplasmids,stringent(嚴緊型)controlofDNAreplicationHighcopynumberplasmids,relaxedplasmid(松弛型)按照是否含有trans基因將質(zhì)粒分為結合型質(zhì)粒和非結合型質(zhì)粒。Trans基因是一種可以指令寄主細胞產(chǎn)生鞭毛，合成細胞表面物質(zhì)，促使寄主細胞與其他細胞相接合，導致遺傳物質(zhì)從一個細胞轉移到另一個細胞。我們把含有trans基因的質(zhì)粒稱為結合型質(zhì)粒，把不含有trans基因的質(zhì)粒稱為非結合型質(zhì)粒。在基因工程中我們一般選用什么樣的質(zhì)粒？松散型、非結合型

質(zhì)粒的命名：p，plasmid表示質(zhì)粒，隨后的兩三個大寫字母表示誰發(fā)現(xiàn)和發(fā)明了該質(zhì)粒，數(shù)字表示質(zhì)粒分離的次數(shù)或者構建的一系列質(zhì)粒的編號。例：pBR322二、質(zhì)粒克隆載體質(zhì)粒經(jīng)改造后即可成為基因工程載體。如前述pBR322，載體需有克隆位點和標記基因。標記基因種類很多：1）抗性標記基因（可直接用于選擇轉化子）a.

抗生素抗性基因:Apr，Tcr，Kanr，G418r，Hygr，Neorb.重金屬抗性基因:Cur，Znr，Cdrc.代謝抗性基因:抗除草劑基因2）營養(yǎng)標記基因（可直接用于選擇轉化子）。主要是參與氨基酸，核苷酸及其他必需營養(yǎng)物合成酶類的基因，這類基因在酵母轉化中使用最頻繁，如TRP1，URA3，LEU2，HIS4等。3）生化標記基因。其表達產(chǎn)物可催化某些易檢測的生化反應，如lacZ,GUS,CAT。葡萄糖苷酸酶基因（GUS）該基因編碼一種可分解各種β-葡萄糖苷酸酶基因衍生物的水解酶。該標記基因除具有上述lacZ基因的優(yōu)點外，它的適用范圍十分廣泛，因為許多生物中沒有這種基因。熒光素酶基因熒光素酶或由螢火蟲產(chǎn)生的可催化蜜蜂熒光素氧化的酶，并產(chǎn)生熒光，若在反應中加入CoA，可使靈敏度提高10倍；或由發(fā)光細菌（Photobacteriumfischeri）產(chǎn)生的熒光素酶，它與FMN-氧化還原酶聯(lián)用，通過NAD(P)H的變化測定酶活。發(fā)光蛋白質(zhì)基因發(fā)光蛋白是由水母產(chǎn)生的一種可發(fā)光的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)可使大腸桿菌菌落呈藍色。

β—半乳糖苷酶基因（lacZ和lacZα）β—半乳糖苷酶基因有1021AAs，基因產(chǎn)物不具酶活性，裝配為四聚體后才有酶活。該蛋白質(zhì)可分為兩部分：α鏈和β鏈。前者負責四聚體裝配，后者具β—半乳糖苷酶活性；只有當兩者都存在時，才會表現(xiàn)出酶活性，該作用稱之為α-互補作用。這兩個部分可獨立存在，分別由兩個基因編碼。為α鏈編碼的基因稱之為lacZα(編碼145AAs)。這兩個基因（LacZ和LacZα）均可作為標記基因。

β—半乳糖苷酶基因的優(yōu)點:

a.

酶催化X-Gal水解為蘭色產(chǎn)物，檢測直觀b.

lacZα編碼5'-端可容許很大的變化而不影響酶活性c.lacZα和β鏈基因的分別表達可使載體小而容量大三、構建質(zhì)?？寺≥d體的基本策略（Slightlymoreexoticplasmidvectors）1能在轉化的受體中進行有效復制、有較多拷貝數(shù)（松弛型的質(zhì)粒ori）。2克隆位點：盡可能多一些，至少有一個。可用MCS連桿，MCS是指含多種內(nèi)切酶識別序列的多克隆位點（multiplecloningsite），又稱多聚接頭（polylinker）。3篩選標記基因：選擇標記區(qū)內(nèi)有合適的克隆位點，當外源DNA插入時，標記gene將失活而成為篩選的標識。4構建的質(zhì)粒克隆載體應盡可能小。大于15kb的plasmid轉化效率明顯。5根據(jù)需要，使構建的質(zhì)?？寺≥d體組裝各種“元件”（小DNA片段）。如插入啟動子，終止子。Puc18/19克隆載體：1.2.68kb2.ori來源于松弛型質(zhì)粒ColE1的復制起始位點，可在大腸桿菌E.ColiHB101,E.ColiC600等細胞中高效復制（DH5α）。3.含報告基因LacZ，lacZ取代了pBR332中的Tcr基因。PLacZαLacZβ

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αβpUC18

BamHI片段重組DNA分子轉化E.coli外源DNABamHI片段

涂布在含X-Gal和Ap的平板上,白色菌落為重組子，蘭色菌落為原載體利用LacZ基因篩選重組子pUC18/19中l(wèi)acZ序列篩選：lacZ來源于乳糖操縱子，含有啟動子、調(diào)節(jié)因子和β-半乳糖苷酶的α-肽基因（lacZ）。該基因產(chǎn)物在含IPTG（異丙基-β-D-硫代半乳糖苷）和X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖）培養(yǎng)基培養(yǎng)時，菌落是藍的。陽性克?。ㄞD化子）是白色的。pUC系列質(zhì)粒載體由Messingetal.構建，具有三個顯著特點：1.分子量小，僅為2.7KB，容納外源DNA量增大2.易于檢測是否有外源DNA插入的標記基因LacZα3.多克隆位點區(qū)1)多克隆位點成對地存在于pUC18和pUC19中，位點排列順序相同，但方向相反,有利于外源DNA的克隆和定向插入2)產(chǎn)生不同末端規(guī)律排列:兩端限制酶位點產(chǎn)生5’-突起端（EcoRI和HindⅢ),與之相鄰的兩個限制酶位點產(chǎn)生3’-突起端（SstI、KpnI、SphI、PstI),中央四個限制酶位點產(chǎn)生5’-突起端或平端。這種排列方式十分有利于插入DNA片段的單向缺失和缺失片段的回收。pUCfamilyPolylinkerormultiplecloningsite[MCS]pUCm-T載體(pUCm-TVector):1線性化的載體，2載體每條鏈的3’端帶有一個突出的T。第三節(jié)大腸桿菌的噬菌體載體（BacteriophagevectorsforuseinE.Coli)一、噬菌體的定義（Whatarebacteriophages）噬菌體是吃細菌的病毒顆粒（viruses,“eaterofbacteria”）。CapsidtailGene3proteinCoatproteinDNAPhagesfallintothreemaingroups:

(1)tailless(2)headwithtail

(3)Filamentous（細絲狀）Geneticmaterial:(1)single-strandedRNA(2)double-strandedDNA病毒由DNA（orRNA）、外殼蛋白組成，經(jīng)包裝后成為病毒顆粒。進入宿主細胞后，利用宿主細胞的合成系統(tǒng)進行DNA（orRNA）復制和殼蛋白的合成。DNA和RNA不能共存于同一種病毒中。噬菌體有嚴格的宿主專一性，限制了其作為載體使用的范圍。溫和噬菌體（Temperatephages）：插入宿主染色體DNA→隨著宿主細胞的復制而復制→溶原階段（LysogenicCycle）烈性噬菌體（Virulentphages）：不插入宿主染色體DNA→自主復制→溶菌階段（LyticCycle）二、λ噬菌體載體（Vectorsbasedonbacteriophageλ）1.λDNA的特點1)λDNA：λ噬菌體中的DNA，線狀，48.5kb，編碼46個基因，集中于頭部。2)cos位點：左右兩端各12個核苷酸組成的5’-粘性末端。兩者核苷酸序列互補，λDNA在包裝前是線狀的，在包裝后是環(huán)狀的。3）46gene：成簇排列。不是所有gene都是生長必需的。Capsidcomponents衣殼合成從A到J基因——左側區(qū)Integration&excision分裂合成（陰影區(qū)為基因操作中非必需部位）Early(late)regulation早、晚調(diào)節(jié)DNAsynthesisDNA合成Lysis釋放4）有56種限制性核酸酶的酶切位點5）λ噬菌體的生長途徑有兩種。LysisofcellandreleaseofmaturephageparticlesInductionLysogenicresponeCelldivisionLyticresponepSuchasultravioletlightAssembledorpackaged5）λ噬菌體的生長途徑有兩種。λ噬菌體載體感染E.coli→λDNA注入細胞→（溶菌階段）→cos位點連接→復制→在R和S蛋白作用下細胞破裂λ噬菌體載體感染E.coli→λDNA注入細胞→（溶原階段）→在宿主細胞int基因作用下插入宿主染色體→復制紫外線2.λ噬菌體作為克隆載體的依據(jù)①λ噬菌體溫和噬菌體，感染性高，易操作。②λ噬菌體可承載大的外源DNA。可承載的外源DNA為λDNA的75%-105%（即38-51kb）且λDNA上有20kb的區(qū)域對λ噬菌體并非必需，可取代或缺失。3.λ噬菌體載體類型λ噬菌體載體有兩種類型，即插入型載體（Insertionvectors）和替換型載體（replacementvectorsorsubstitutionvector）。1.插入型載體（Insertionvectors）：多用于cDNA構建文庫。1）免疫功能失活型如λgt10，其左、右臂之間有一個CI基因，該基因應用了imm434免疫區(qū)段。該區(qū)段完全時，出現(xiàn)渾濁的噬菌斑——λ噬菌體進入溶菌階段；該區(qū)域被破壞時，CI基因失活，結果產(chǎn)生清晰的噬菌斑?？梢酝ㄟ^形態(tài)學上的差異將兩者分開。2)β-半乳糖苷酶失活型如Charon16A，λgt11。2.替換型載體（replacementvectorsorsubstitutionvector）常用于基因組文庫構建在左右臂之間有填充物，可以被外源DNA所取代，中央可取代片段兩側的多克隆位點是反向重復序列，因此當外源DNA插入時，一對克隆位點之間的DNA序列將被替換掉。Stuffers和polystuffer區(qū)可以被替換掉。EMBL4：當用兩端酶切位點時，中間也可以用其他酶切割一下，以防原噬菌體片段退火。Charon40：中間含有多節(jié)段區(qū)（polystuffer），MCS是反向重復序列。兩者可容納外源DNA能力9-22kb之間。

使用替換型載體克隆外源DNA包括三個步驟：①用恰當限制性酶消化λ載體，除去基因組中可替代的部分②將上述所得λDNA臂同外源DNA相連接③重組體的λDNA分子進行包裝和增殖，以得到有感染性的λ重組噬菌體圖3-8置換型載體組成示意圖圖3-9λEMBL3載體結構示意圖Phagemids(phasmids):thephagefunctionsareexpressed,forexample,λZAPfamilybystrategene.二、凱倫噬菌體載體凱倫噬菌體載體（Charonvector）是F.RBlattner在1977年在λ噬菌體基礎上發(fā)展出來的一種特殊噬菌體載體。Charon：是古希臘神話中一名老擺渡工，專門負責在斯蒂克斯河（Riverstyx）上，運送亡靈到陰間。

容納能力感染效率質(zhì)粒：nkb-nbp低，0.1%轉化率

λ噬菌體：大片段，nkb-23kb高幾乎每個顆粒都有100%感染率圖3-11λGEM-II載體結構示意圖三、M13噬菌體

M13噬菌體是一種絲狀（filamentous）噬菌體，內(nèi)含有環(huán)狀、單鏈DNA分子（“+”鏈DNA）,長為6407個核苷酸，含DNA復制和噬菌體增殖所需的遺傳信息，可分為10個區(qū)。還有一個長507個核苷酸的基因間隔區(qū)（IS區(qū)），從第5489個核苷酸到第6005個核苷酸。M13的復制起點定位在基因間隔區(qū)內(nèi)，但IS區(qū)內(nèi)有些核苷酸序列即使發(fā)生突變、缺失或插入外源DNA，也不會影響M13DNA的復制，這為M13DNA構建克隆載體提供了條件?？删幋a三類蛋白質(zhì)：復制蛋白質(zhì)（基因Ⅱ，Ⅴ，Ⅹ）形態(tài)發(fā)生蛋白質(zhì)（基因Ⅰ，Ⅳ，Ⅺ）結構蛋白質(zhì)（基因Ⅲ，Ⅵ，Ⅶ，Ⅷ，Ⅸ）M13mp18M13噬菌體周期：①M13噬菌體通過鞭毛吸附，感染雄性大腸桿菌，M13噬菌體的“+”鏈進入細胞內(nèi)，以此為模板，復制互補的“-”鏈DNA。由此產(chǎn)生的雙鏈M13DNA稱為復制型DNA（RF-DNA）。RF-DNA按一般環(huán)狀雙鏈DNA進行復制。②當細胞內(nèi)RF-DNA達到近200個拷貝時，則RF-DNA中的“+”鏈DNA被單鏈特異的DNA結合蛋白結合，阻止“+”鏈DNA的復制合成。結果，細胞內(nèi)只能以“-”鏈為模板不斷復制合成新的“+”鏈DNA。③新合成的“+”鏈DNA立即被積累在細胞內(nèi)的殼蛋白包裝成新的噬菌體顆粒，并不斷擠出宿主細胞。（單鏈，“+”鏈→存在于噬菌體中，雙鏈DNA存在于宿主細胞中。）M13噬菌體周期的特點：①增殖過程不會導致宿主細胞的溶菌生長，被感染的細胞一個世代可以釋放1000個子代噬菌體。M13包裝DNA分子的能力可達M13DNA本身的6倍。②制備的M13DNA，單、雙鏈均可轉染大腸桿菌受體細胞，因此M13DNA作為載體時，不必進行體外包裝就可以直接轉染受體細胞。第四節(jié)原核生物應用的其他載體一、cosmid質(zhì)粒載體①λ噬菌體特點：兩端部少于280bp，且含有cos位點，可以插入36.4-51kb長度的DNA；②質(zhì)?？寺≥d體特點：不用包裝即可轉導?？寺∧芰σ话悴怀^10kb，載體大小一般也在10kb以下，是環(huán)狀雙鏈DNA.cosmid質(zhì)粒載體特點：將λ