鐵皮石斛的市場前景

喂食側(cè)柏屬植物和多年生附生草本植物，莖的莖為黑色，也被稱為黑節(jié)草，主要分布在浙江、云南、廣西、湖南、貴州等地。鐵皮石斛是我國傳統(tǒng)名貴中藥材,具有滋陰清熱、益胃生津、潤肺明目、清咽利嗓、抗癌防老等功效,是2010版《中華人民共和國藥典》唯一單列收載的石斛屬植物。鐵皮石斛的種子極小、無胚乳,自然條件下需與某些真菌共生才能萌發(fā),很難用實生苗栽培,而傳統(tǒng)的分株、扦插等方式的繁殖率極低,加上人為的過度采挖和破壞生態(tài)環(huán)境,其資源已瀕臨滅絕,因而被國家列為重點保護的藥用植物之一。為滿足國內(nèi)外市場經(jīng)濟發(fā)展和臨床醫(yī)學的需要,從20世紀70年代開始,國內(nèi)科研工作者開始對鐵皮石斛組織培養(yǎng)和人工栽培進行研究,20世紀80年代,浙江省醫(yī)學科學院率先對鐵皮石斛組織培養(yǎng)技術(shù)取得突破并用于生產(chǎn),國內(nèi)掀起了鐵皮石斛的組織培養(yǎng)熱。筆者就近年來鐵皮石斛無菌播種,原球莖誘導、增殖及分化、壯苗生根,叢生芽的誘導,離體開花,人工種子與種質(zhì)資源保存,四倍體誘導等組培技術(shù)的研究現(xiàn)狀進行綜述,以便為今后的研究提供參考。1無菌播種熱帶附生蘭的種子,可以通過處理,以無菌萌發(fā)的方式進行萌發(fā)建立無性繁殖系。1.1種子萌發(fā)期不同不同胚齡的鐵皮石斛種子,萌發(fā)率和萌發(fā)期明顯不同。葉秀粦等、曾宋君等對不同胚齡鐵皮石斛種子誘導培養(yǎng)發(fā)現(xiàn):幼胚胚齡在2月以下時,種子萌發(fā)率很低,隨著胚齡的增長,其萌發(fā)率逐漸升高,萌發(fā)期逐漸縮短,達一定的胚齡后,萌發(fā)期差異并不顯著。2月以下的種胚播種時發(fā)育不良,萌發(fā)率低;過晚播種則果皮開裂,果實內(nèi)的種子易受污染,難以消毒。因此采用4月胚齡的鐵皮石斛種子無菌播種最佳,這時種子成熟度高、果實尚未破裂,易進行無菌播種,種子萌發(fā)率高且萌發(fā)后的生長狀況好。1.2不同培養(yǎng)基對鐵皮石斛種子萌發(fā)的影響采用合適的培養(yǎng)基是鐵皮石斛種子萌發(fā)的關(guān)鍵,B5、1/2B5、N6、1/2N6、MS、1/2MS、SH、1/2SH、WPM、VW、KundsonC、White和HyponexNO.1等多種基本培養(yǎng)基都可使鐵皮石斛種子萌發(fā),但萌發(fā)所需的時間、萌發(fā)率及小苗長勢不同。曾宋君等在研究鐵皮石斛等石斛種子在MS、KS、VW、KnudsonC、N6為培養(yǎng)基進行離體培養(yǎng)時,得出了硝態(tài)氮遠高于銨態(tài)氮的N6培養(yǎng)基有利于石斛的萌發(fā)和生長。鄭志仁等利用MS、1/2MS、B5、N6、KC為培養(yǎng)基對鐵皮石斛進行誘導培養(yǎng),得到不同的結(jié)論:在MS、1/2MS培養(yǎng)基上萌發(fā)率較高,在KC培養(yǎng)基上次之,N6培養(yǎng)基上較低。杜剛等利用VW培養(yǎng)基對鐵皮石斛進行誘導也取得了較高的萌發(fā)率。謝啟鑫等利用MS、1/2MS、HyponexNO.1培養(yǎng)基進行誘導培養(yǎng),得出1/2MS適合鐵皮石斛的種子培養(yǎng)結(jié)論。曾萬勇等利用WPM、MS、1/2MS和1/3MS培養(yǎng)基進行誘導培養(yǎng),在WPM培養(yǎng)基中發(fā)芽率最高,但對MS培養(yǎng)基來說,與謝啟鑫等得出結(jié)論相似:較適宜的培養(yǎng)基為1/3MS和1/2MS,最不適宜的為MS培養(yǎng)基。從曾萬勇、謝啟鑫等研究結(jié)果可得出:在低鹽濃度的培養(yǎng)基中易于誘導鐵皮石斛種子萌發(fā),高鹽離子不利于鐵皮石斛的萌發(fā)與生長。因此在研究及實際生產(chǎn)中大多采用1/2MS培養(yǎng)基作為種子誘導培養(yǎng)基。1.3激素對鐵皮石斛種子萌發(fā)的影響鐵皮石斛種子在基本培養(yǎng)基上可以萌發(fā),但添加適當比例的激素或天然附加物能提高萌發(fā)率,并加快萌發(fā)速度和生長速度。鄭志仁等研究認為0.5~1.0mg·L-16-BA對鐵皮石斛種子萌發(fā)有抑制作用,但有促進原球莖增殖效果;而0.5~1.0mg·L-1NAA則促進鐵皮石斛種子萌發(fā),不僅萌發(fā)率增高,而且萌發(fā)整齊,與曾宋君等結(jié)論相同。李榮珍研究認為鐵皮石斛種子萌發(fā)的各種激素影響因子依次為NAA、2,4-D,并得出較適合鐵皮石斛種子萌發(fā)的培養(yǎng)基是1/2MS+NAA0.3mg·L-1+蔗糖30g·L-1。張銘等研究認為NAA在0.05~2.0mg·L-1范圍內(nèi)都能促進種胚萌發(fā),而2,4-D促進種胚萌發(fā)的濃度范圍很窄,僅在濃度為0.5mg·L-1時能促進種胚萌發(fā)。周麗研究認為NAA濃度在0.2~0.5mg·L-1最適合胚的萌發(fā)和生長,高于5mg·L-1則起抑制作用;6-BA對胚萌發(fā)后胚狀體的形成和生長有抑制作用,但其用量小且又有NAA存在的情況下能形成胚狀體和分化小芽。杜剛等用實驗設(shè)計軟件Design-Expert6.0.6進行Simplex-Lattice實驗設(shè)計和優(yōu)化,得出鐵皮石斛種子萌發(fā)的各種激素影響因子依次為NAA、GA、6-BA,優(yōu)化激素組合為:NAA0.18mg·L-1+6-BA0.53mg·L-1+GA0.28mg·L-1。由此可見,鐵皮石斛種子不需要外源激素即可萌發(fā),單獨加BA抑制種子萌發(fā),NAA或BA與NAA適宜比例的組合能促進其萌發(fā)。通過研究表明,在培養(yǎng)基中添加10%椰子汁、10%馬鈴薯汁等天然營養(yǎng)物質(zhì),對鐵皮石斛種子萌發(fā)和生長都有明顯的促進作用。添加適量活性炭可防止褐變,對幼苗成長有利,但對種子萌發(fā)無明顯影響。而楊柳平等則認為在培養(yǎng)基中添加天然提取物不利于種子萌發(fā)。2組培快繁的主要形式原球莖繁殖是蘭科植物組織培養(yǎng)的特有現(xiàn)象,是其組培快繁的主要形式。以鐵皮石斛莖尖、莖段、根尖等為外植體誘導原球莖已獲得成功,但選用不同的外植體,所采用的培養(yǎng)基配方及培養(yǎng)效果各有所不同。2.1外植體的選擇2.1.1上誘導對原球莖的誘導莖尖是細胞分裂最旺盛部分,誘導成功率較高。王春等用鐵皮石斛的莖尖作為外植體,接種1/2MS+6-BA1.0mg·L-1+NAA0.5mg·L-1培養(yǎng)基上誘導產(chǎn)生原球莖,誘導率為58%。張啟香等研究認為,以1/2MS為基本培養(yǎng)基有利于原球莖誘導,原球莖最優(yōu)誘導培養(yǎng)基為1/2MS+6-BA0.5mg·L-1+NAA0.05mg·L-1+KT0.1mg·L-1+LH1.0g·L-1,并得出土豆汁對原球莖的增殖有很好的促進作用的結(jié)論。而溫焱光等采用基本培養(yǎng)基不同,他們將莖尖和腋芽接種于MS+6-BA2.0mg·L-1+NAA0.1mg·L-1培養(yǎng)基上誘導,20d誘導出愈傷組織,2個月后獲得原球莖。2.1.2最佳培養(yǎng)基的確定鐵皮石斛帶芽莖段取材容易,誘導成功率高,是理想的外植體。常美花等研究認為鐵皮石斛帶芽莖段原球莖誘導的最佳培養(yǎng)基為MS+6-BA1.0mg·L-1+NAA0.5mg·L-1+AC2.0g·L-1;而不加激素的MS培養(yǎng)基鐵皮石斛的原球莖誘導率為0。李丹等研究也認為不加激素的MS培養(yǎng)基鐵皮石斛的原球莖誘導率為0,原球莖誘導的最佳培養(yǎng)基是MS+KT1.0mg·L-1+NAA0.1mg·L-1;NAA是原球莖誘導的關(guān)鍵因子,適宜的KT與NAA配比對原球莖誘導有促進作用。蘇鈦等則認為NAA并不是原球莖誘導的關(guān)鍵因子,他們用正交設(shè)計方法對鐵皮石斛原球莖誘導具有影響的激素BA、NAA、KT以及馬鈴薯汁進行配比研究,結(jié)果表明:以莖段為外植體在培養(yǎng)基MS+BA2.0mg·L-1+NAA2.0mg·L-1+馬鈴薯汁10%+糖3%,具有很好的原球莖誘導作用,50d后誘導率達95.20%;對BA、NAA、馬鈴薯汁進行LSD多重比較分析,BA濃度2.0mg·L-1和0.5mg·L-1之間均值差異大,存在顯著差異,而且在濃度2.0mg·L-1時原球莖誘導率最高。NAA和馬鈴薯汁對誘導率無顯著影響,但是當NAA2.0mg·L-1,馬鈴薯汁10%時,誘導的原球莖分化少,原球莖質(zhì)地較好,因此為最佳濃度BA相對于其他激素對鐵皮石斛原球莖誘導效果最好,以2.0mg·L-1BA誘導率最高。2.1.3抗吸能力分離株的獲得再生以鐵皮石斛根尖為外植體誘導原球莖的誘導率相對較低。詹忠根等以鐵皮石斛離體根尖誘導類原球莖表明,外植體在改良B5培養(yǎng)基誘導培養(yǎng)形成了愈傷組織、類原球莖或直接轉(zhuǎn)化成芽且獲得再生植株。2.2甘蔗的原始繁殖和分解2.2.1最佳培養(yǎng)基的篩選原球莖增殖是鐵皮石斛組織培養(yǎng)過程中一個十分關(guān)鍵的環(huán)節(jié),通過原球莖增殖,可為之后的分化、壯苗生根奠定基礎(chǔ)。張治國等研究了6種基本培養(yǎng)基(1/2MS、MS、N6、B5、KC、VW)對原球莖增殖的影響,其中1/2MS培養(yǎng)基上的原球莖色淡黃,體積大,無分化且增殖適宜,是適宜鐵皮石斛原球莖增殖的基本培養(yǎng)基。培養(yǎng)基中不同激素濃度配比對原球莖增殖具有重要影響。楊柳平等通過研究認為不同激素配比對原球莖增殖效果不同,NAA、KT、6-BA在適宜的濃度時對原球莖的增殖起促進作用。戴傳云等用正交試驗篩選出鐵皮石斛原球莖增殖的最佳培養(yǎng)基為1/2MS+2.0mg·L-16-BA+0.5mg·L-1NAA+1.0mg·L-1KT;該研究結(jié)果認為,在一定范圍內(nèi),在含有高濃度的6-BA和低濃度的NAA的1/2MS培養(yǎng)基上,原球莖增殖系數(shù)大,增殖效果較好;KT在鐵皮石斛原球莖增殖的過程中雖不是必要激素,但加入KT能明顯提高原球莖的增殖速率。張桂芳等認為2,4-D對原球莖的生長和增殖不利,一定濃度的BA、KT和NAA有利于原球莖的增殖;KT濃度為1.0mg·L-1時,原球莖40d增殖倍數(shù)最高,達9.0。2.2.2高濃度細胞分裂素ba與低濃度生長素naa組合原球莖進行分化可形成叢生芽,不同培養(yǎng)基對石斛原球莖分化整齊度、健壯度、分化率影響不一。張治國等研究認為,高濃度細胞分裂素BA與低濃度生長素NAA組合,即2mg·L-16-BA和0.2mg·L-1NAA組合(10∶1),能使原球莖分化的速度加快。邵世光等以N6為基本培養(yǎng)基,激素配比與張治國等相似:2mg·L-16-BA和0.2mg·L-1IBA組合(10∶1),原球莖最易于分化成叢生小苗。2.2.3馬鈴薯汁對原球莖的影響通過研究表明,培養(yǎng)基中添加物不同,原球莖繼代增殖及分化效果也不同。香蕉汁有利于原球莖的繼代增殖,馬鈴薯汁能明顯促進原球莖的分化。楊柳平等則認為添加蘋果汁對鐵皮石斛原球莖的增殖效果好,土豆汁能有效促進鐵皮石斛原球莖的分化,但香蕉汁對原球莖的增殖和分化有抑制作用。蔗糖作為培養(yǎng)基的能源物質(zhì)和滲透調(diào)節(jié)劑,對原球莖的增殖生長影響也較大,3%蔗糖濃度有利于原球莖增殖,而2%蔗糖濃度有利于原球莖分化。2.3植物激素種類的選擇有關(guān)研究表明,一般在不加激素的播種培養(yǎng)基上鐵皮石斛種苗會自動生根,但添加香蕉汁、蔗糖、活性炭等對生根壯苗有明顯促進作用,而添加激素對生根影響極大。劉驊等對基本培養(yǎng)基、天然提取物、香蕉提取物濃度和激素種類的選擇進行了研究,結(jié)果表明鐵皮石斛壯苗基本培養(yǎng)基以B5或1/2MS為好,天然提取物選用香蕉汁,香蕉汁濃度為10%,植物激素以2mg·L-1的NAA較好。陳兆貴等研究認為組培苗的壯苗生根在1/2MS+IBA2.0mg·L-1+水解酪蛋白500mg·L-1+10%香蕉提取液的培養(yǎng)基上效果較好,45d生根率達92%。3叢生芽的培養(yǎng)以鐵皮石斛帶芽莖段為外植體直接誘導腋芽,再將腋芽培養(yǎng)形成叢生芽是鐵皮石斛快速繁殖的一種新途徑。采用帶芽莖段離體培養(yǎng)叢生芽,不經(jīng)過愈傷組織階段,能直接萌發(fā)出芽,有利于保持該品種遺傳性狀穩(wěn)定。在外植體選擇方面上,李進進研究認為,選用一年生嫩莖中部莖段誘導培養(yǎng),產(chǎn)生的叢生芽數(shù)量多,芽的平均長度長而且生長良好。朱艷等以鐵皮石斛的莖段作外植體,比較不同的培養(yǎng)基、激素等因素對莖段分化叢生芽的影響,以及不同濃度的香蕉汁和活性炭對試管苗生根的影響。研究結(jié)果表明:1/2MS較好,BA作用優(yōu)于KT、ZT,最適濃度為2.0mg·L-1;叢生芽培養(yǎng)于1/2MS+10%香蕉汁+0.5%AC的培養(yǎng)基上,生根效果最好。這與郭洪波等研究結(jié)果有所不同,郭洪波等研究認為,外植體在MS+6-BA5.0mg·L-1+NAA(0~0.8mg·L-1)上誘導叢生芽最好,誘導率高達93.33%,增殖培養(yǎng)基為MS+6-BA5.0mg·L-1+NAA0.4mg·L-1+20%香蕉汁。洪森榮等研究認為,不添加任何植物激素的MS對鐵皮石斛帶芽莖段根的分化最為有利,但添加了KT和NAA后,對芽的分化有促進作用,細胞分裂素KT與生長素NAA配比高的培養(yǎng)基,繁殖系數(shù)高,反之繁殖系數(shù)低。4激素對鐵皮石斛花芽形成的調(diào)控在離體培養(yǎng)條件下,鐵皮石斛可在試管、廣口瓶等培養(yǎng)容器中開花。王光遠等研究了多種植物激素和多胺對鐵皮石斛組織培養(yǎng)中花芽形成的影響,表明在培養(yǎng)基中加入合適濃度的亞精胺或BA,或同時加入NAA和BA均可誘導原球莖或由之形成的無根小苗在3~6個月開花,頻率在31.6~45.8%之間。當將原球莖在加有ABA的培養(yǎng)基上預培養(yǎng)后再移到加有BA的培養(yǎng)基上,花芽形成的頻率可提高到82.8%(個別實驗中可達100%)。周麗將3個月苗齡的組培苗在KaudsonC+2,4-D0.2mg·L-1+ZT0.6mg·L-1的培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)2個月后,可誘導出一定數(shù)量的花芽,然后轉(zhuǎn)接于KaudsonC+香蕉提取物100g·L-1的無激素的培養(yǎng)基上可正常開花,花大且形態(tài)正常,花期3周左右。岑秀芬等研究了激素因子對鐵皮石斛離體培養(yǎng)開花誘導的效應,表明PP3330.3mg·L-1+6-BA0.5mg·L-1+NAA0.5mg·L-1+TDZ0.06mg·L-1為適宜的激素組合,其花芽形成率和花開放率高達80.4%和90.3%。通過離體開花技術(shù)可制作成鐵皮石斛微型觀賞品,具有運輸方便、無需管理等優(yōu)勢。由于組織培養(yǎng)過程中有一定的變異率,可通過離體開花篩選新的花型,通過雜交可進一步培育株型高大、兼具藥用價值和觀賞價值的優(yōu)良石斛品種。5人工種子和胚胎血漿資源的保存鐵皮石斛自然條件下種子萌發(fā)率極低,通過人工種子或低溫等處理,可有效保存并開發(fā)種質(zhì)資源。5.1炭或淀粉添加量郭順星等以原球莖為材料,以改良1/2MS培養(yǎng)基各種成分附加蔗糖為人工胚乳,初步建立了鐵皮石斛人工種子制作流程。張銘等應用粘土和蛭石粉作基質(zhì)包埋鐵皮石斛種胚來制作人工種子,當粘土∶蛭石粉∶MS培養(yǎng)液為2∶1∶2時萌發(fā)率可達56.8%。在此系統(tǒng)中單獨添加1.0%活性炭或同時添加1.0%活性炭和0.5%淀粉制作的鐵皮石斛人工種子,平均萌發(fā)率分別達76.7%和80.3%。張桂芳等對人工種子制作及影響因素進行了研究,表明以MS+0.5mg·L-1BA+0.5mg·L-1NAA+3g·L-1AC+30g·L-1海藻酸鈉+3g·L-1百菌清為基本胚乳,在2%CaCl2中反應15min是鐵皮石斛人工種子制作的較佳條件,胚乳中分別添加15g·L-1木薯淀粉和10g·L-1保水劑能明顯提高人工種子的萌發(fā)率和成苗率,種皮中添加10L納米SiO2和10L納米TiO2均能明顯提高萌發(fā)率,但添加10L納米SiO2成苗率最高。曾穎蘋等進行了鐵皮石斛人工種子包衣技術(shù)研究,表明以萌發(fā)原球莖為繁殖體的人工種子萌發(fā)率和成活率較高,適宜的人工胚乳組合為蔗糖3.0%、ABA1.0mg·L-1、活性炭濃度0.5%、多菌靈3.0%、海藻酸鈉3.0%。5.2超低溫保存研究史永忠等將鐵皮石斛試管苗培養(yǎng)在1/2MS,附加0.5mg·L-1NAA、20mg·L-1蔗糖、0.5g·L-1活性炭和7g·L-1瓊脂的培養(yǎng)基上,室溫條件下連續(xù)保存12個月,存活率達100%。王君暉等用液氮對鐵皮石斛的種子、原球莖和類原球莖體進行了超低溫保存研究,表明把4個月齡的種子脫水至含水量為12~19%,能獲得較高的凍后存活率(95%)和較快的恢復生長速率;原球莖用玻璃化保護劑PVS2處理15min,其凍后存活率可達88%;類原球莖的含水量在6~7d內(nèi)干燥至30±2%,其凍后存活率可達48~80%。陳勇等對鐵皮石斛的原生質(zhì)體、原球莖進行了玻璃化法超低溫保存研究,存活率分別達48%和88%。林偉強等用空氣干燥法成功地凍存了鐵皮石斛的種子及初生原球莖。羅吉鳳等研究表明離體保存材料可采用試管叢芽和原球莖兩種方式,以保持其遺傳多樣性。保存方法是:在15℃左右條件下,保存離體材料,繼代間隔期為12~18個月;也可以采用室溫保存,在1/2MS+蔗糖1%培養(yǎng)基上,繼代間隔期可延長至10~12個月。6鐵皮石斛的誘導與二倍體