組織培養(yǎng)結(jié)合秋水仙堿誘導(dǎo)植物多倍體的研究進(jìn)展

該技術(shù)是在傳統(tǒng)的化學(xué)誘導(dǎo)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，并隨著植物組織培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展而成熟。目前該項(xiàng)技術(shù)在國內(nèi)外被育種學(xué)家廣泛用于培育多倍體，以求達(dá)到改良植物品種和豐富種質(zhì)資源的目的。1優(yōu)勢和劣勢1.1組織培養(yǎng)、誘導(dǎo)培育植物多倍體的傳統(tǒng)誘導(dǎo)法是以植株生長點(diǎn)、葉芽或種子等為誘導(dǎo)對(duì)象，由多細(xì)胞構(gòu)成的芽發(fā)育成植株，因細(xì)胞分裂不同步，容易形成嵌合體，難于獲得同質(zhì)的多倍體，誘導(dǎo)率也較低。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，通過對(duì)材料進(jìn)行組織培養(yǎng)然后再作誘導(dǎo)處理，能使誘導(dǎo)加倍的多倍體單細(xì)胞分化出不定芽，并發(fā)育成單株，形成同質(zhì)多倍體，提高誘導(dǎo)率，有效排除嵌合體的干擾，并且縮短多倍體培育時(shí)間。曾憲松等用0.5%秋水仙堿處理橡膠樹(Heveabrasiliensis)二倍體花藥體細(xì)胞愈傷組織1d，可有效地從多倍性的細(xì)胞再分化成多倍性胚狀體，并再生為純合的四倍體植株，克服了常規(guī)誘導(dǎo)法造成的嵌合體現(xiàn)象及其所存在的多種弊端，且大大縮短了培育純合四倍體的時(shí)間。1.2養(yǎng)結(jié)合秋水仙堿誘導(dǎo)培育植物的培養(yǎng)模式常規(guī)的多倍體誘導(dǎo)試驗(yàn)常在室外進(jìn)行，室外的溫度、光照等試驗(yàn)條件難于控制，而組織培養(yǎng)結(jié)合秋水仙堿誘導(dǎo)培育植物多倍體是在室內(nèi)進(jìn)行，室內(nèi)試驗(yàn)條件容易控制，且易于重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果，提高工作效率。目前隨著組織培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展與成熟，越來越多植物的快繁體系已被建立，這也為利用組織培養(yǎng)與秋水仙堿誘導(dǎo)相結(jié)合培育植物多倍體提供了良好的基礎(chǔ)。2仙堿對(duì)外植體的作用較常用的誘導(dǎo)方法有滴液法、浸漬法、混培法。由于秋水仙堿對(duì)外植體有一定的傷害作用，因而有學(xué)者認(rèn)為，在暗條件或弱光條件下誘導(dǎo)可減輕對(duì)外植體的傷害，同時(shí)處理后的外植體在這種條件下培養(yǎng)一段時(shí)間可起到恢復(fù)的效果。2.1外植體的誘導(dǎo)用無菌的脫脂棉包裹外植體，滴加藥液，保持棉花濕潤，藥液濃度一般為0.1%～0.5%，處理時(shí)間一般為1～3d，常在藥液中加入2%～3%的二甲基亞砜（DMSO）提高誘導(dǎo)率；處理完畢后充分清洗外植體，再接入新鮮的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。周樸華等在弱光條件下用浸有0.02%～0.05%秋水仙堿的棉花包裹黃花菜(Hemerocalliscitrina)的愈傷組織24h后，反復(fù)水洗，再轉(zhuǎn)入芽分化培養(yǎng)基中，獲得同源四倍體黃花菜，同時(shí)發(fā)現(xiàn)藥液中加入2%DMSO，誘導(dǎo)變異的頻率可提高10%左右。2.2外植體的處理秋水仙堿常用的濃度為0.1%～1%，具體濃度視植物對(duì)秋水仙堿的敏感程度而定。操作方法是將外植體浸漬在已過濾無菌的秋水仙堿溶液中，處理時(shí)間一般是2h至2d，處理完畢后充分清洗外植體，再接入新鮮的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。張興翠等將蘆薈(Aole)的叢生芽浸入0.02%～1%秋水仙堿溶液中浸漬24h，充分水洗后轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基中，培養(yǎng)40～60d得到純合的四倍體。有學(xué)者認(rèn)為在振蕩條件下浸漬外植體誘導(dǎo)效果更好。郭啟高等將剝?nèi)パ壳实慕?Zingiberofficinale)芽浸泡于0.05%～0.4%的秋水仙堿溶液中，150r/min振蕩48h，清洗后轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)，能夠獲得較高的誘導(dǎo)率。2.3不同的誘導(dǎo)方法直接在培養(yǎng)基中加入無菌的藥液，藥液的濃度不宜太高，一般為10～300mg/L，外植體處理時(shí)間為幾天至一個(gè)月，處理完畢后直接轉(zhuǎn)入新鮮培養(yǎng)基中，不用清洗外植體。郭啟高等將秋水仙堿滅菌后按5、10、20、30和40mg/L的濃度分別加入姜的分化培養(yǎng)基中，然后接入剝?nèi)パ壳实慕?，處?或10d后再轉(zhuǎn)到不含藥液的新鮮培養(yǎng)基中，獲得四倍體姜的植株。上述誘導(dǎo)方法各有長短，浸漬法省藥、省工，并且藥液還可以回收利用；滴液法、混培法耗藥、費(fèi)時(shí)。對(duì)于不同植物，不同的誘導(dǎo)方法有著不同的誘導(dǎo)效果。陳柏君在誘導(dǎo)黃岑(Scutellariabaicalensis)多倍體時(shí)發(fā)現(xiàn)浸漬法優(yōu)于混培法，而周嘉裕等在誘導(dǎo)辣椒(Capsicumannuum)多倍體時(shí)認(rèn)為混培法優(yōu)于浸漬法。3濃度和時(shí)間組合對(duì)誘導(dǎo)的影響經(jīng)秋水仙堿處理的外植體前期生長緩慢，這是由于秋水仙堿對(duì)外植體細(xì)胞的毒害作用所致。這種毒害作用隨著處理濃度的增加或時(shí)間的延長而加劇，從而使外植體死亡率增加，因此，要掌握合適的處理濃度和時(shí)間才能獲得最好的加倍效果。在離體材料的誘導(dǎo)中，秋水仙堿濃度高，處理時(shí)間長，導(dǎo)致材料死亡率高，但多倍體誘變率并不一定提高；而濃度低，處理時(shí)間短，則不易得到加倍的植株；只有較佳的處理濃度和時(shí)間的組合才能獲得較高的誘導(dǎo)率，如在苧麻、蘋果等植物離體組織的多倍體誘導(dǎo)。但也有人認(rèn)為，用高濃度的秋水仙堿進(jìn)行短時(shí)間處理效果較好，如張俊蓮對(duì)當(dāng)歸的愈傷組織進(jìn)行誘導(dǎo)時(shí)發(fā)現(xiàn)最佳處理為高秋水仙堿濃度與較短的時(shí)間相結(jié)合。不同植物的離體材料對(duì)秋水仙堿的敏感程度有較大差異，有些對(duì)秋水仙堿極其敏感，故只能用較低的濃度進(jìn)行，處理時(shí)間也相對(duì)短些，如誘導(dǎo)庫拉索蘆薈多倍體時(shí)，用0.06%秋水仙堿浸泡叢生芽12h后，誘變頻率達(dá)50%；有些植物的離體材料對(duì)秋水仙堿不太敏感，則可用較高的秋水仙堿濃度進(jìn)行誘導(dǎo)，處理時(shí)間也相對(duì)長些，如巴西橡膠樹在多倍體誘導(dǎo)中，用0.5%秋水仙堿浸泡花藥愈傷組織1d，能得到最高的誘變率。處理溫度對(duì)秋水仙堿的作用有一定影響，過高或過低的溫度均不利于多倍體細(xì)胞的發(fā)生。一般認(rèn)為最適合的溫度為15℃左右，同時(shí)綜合藥液濃度與處理時(shí)間考慮，認(rèn)為溫度低時(shí)藥液濃度可稍大，處理時(shí)間可稍長些，溫度高時(shí)則降低藥液濃度，縮短處理時(shí)間。4選取的誘導(dǎo)材料由于秋水仙堿只能影響正在分裂的細(xì)胞，對(duì)處于靜止?fàn)顟B(tài)的細(xì)胞不起作用，因此，選取的誘導(dǎo)材料原則上必須是幼嫩、分化力較強(qiáng)的組織。目前報(bào)道最多是用愈傷組織和叢生芽作為誘導(dǎo)材料，也有個(gè)別報(bào)道用種子、莖段、離體植株的組織。4.1細(xì)胞再分化培養(yǎng)用秋水仙堿處理植物的愈傷組織時(shí)，體細(xì)胞較容易加倍，加倍的體細(xì)胞再分化成植株，這樣較易獲得純合的四倍體植株。目前很多采用愈傷組織作為誘導(dǎo)材料，也取得較好的效果，如黃錦秀等用0.15～0.2%秋水仙堿處理枸杞愈傷組織，獲得同源四倍體枸杞。4.2附加四倍體叢生芽比較幼嫩，是最常用的誘導(dǎo)材料，經(jīng)秋水仙堿處理后有部分體細(xì)胞會(huì)加倍，由于叢生芽的分化力比較強(qiáng)，加倍后的體細(xì)胞較易分化成植株，這樣也比較容易獲得純合的四倍體植株。如鄭思鄉(xiāng)等用0.1%秋水仙堿處理苧麻(Boehmerianivea)的叢生芽，獲得94%四倍體植株。4.3多倍體再生植株秋水仙堿處理種子后，種子的部分體細(xì)胞已加倍，該種子的胚軸、子葉誘導(dǎo)成的愈傷組織也有部分體細(xì)胞是加倍，由此可分化成多倍體再生植株。如陳素萍等將黨參(Codonopsispilosula)種子播種于含一定濃度秋水仙堿的培養(yǎng)基中發(fā)芽，爾后進(jìn)行胚軸的組織培養(yǎng)，獲得了四倍體變異植株。種子作為誘導(dǎo)材料要經(jīng)過愈傷組織階段，而如果直接用秋水仙堿處理愈傷組織，其誘導(dǎo)率會(huì)更高，操作更方便，也更易獲得純合多倍體植株。因此，目前較少用秋水仙堿處理種子后再結(jié)合組織培養(yǎng)來培育多倍體。4.4多倍體植株的發(fā)育離體植株的組織比較幼嫩，分化力也較強(qiáng)，經(jīng)秋水仙堿處理后體細(xì)胞易于加倍，加倍的體細(xì)胞發(fā)育成的植株為多倍體植株。如劉慶忠等用皇家嘎拉蘋果的離體新梢葉片作為誘導(dǎo)材料，葉片外植體在含有0～200mg/L秋水仙堿的液體再生培養(yǎng)基中培養(yǎng)5d后，再轉(zhuǎn)移到不含有秋水仙堿的再生培養(yǎng)基中培養(yǎng)，獲得四倍體植株。4.5．誘導(dǎo)材料的選擇采用莖段作為誘導(dǎo)材料誘導(dǎo)率較低，嵌合現(xiàn)象較嚴(yán)重，如韓禮星等用半木質(zhì)化半剝皮的獼猴桃(Actinidchinensis)莖段作誘導(dǎo)材料，接入含100～500mg/L秋水仙堿的分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)30d，獲得的多倍體植株都是嵌合體。上述五種誘導(dǎo)材料，誘導(dǎo)效果較好的是愈傷組織和叢生芽，其次為種子和離體植株的組織，較差的是莖段。但是誘導(dǎo)材料的選取與植物組織培養(yǎng)的過程密切相關(guān)，如蘆薈的組織培養(yǎng)過程是由莖尖直接分化叢生芽，則選取誘導(dǎo)蘆薈多倍體的誘導(dǎo)材料只能是叢生芽；黃岑的組織培養(yǎng)過程是種子莖段—愈傷組織—叢生芽，可選取愈傷組織或叢生芽作誘導(dǎo)材料。不同的誘導(dǎo)材料對(duì)誘導(dǎo)的效果也有所不同，如吳清在金蕎麥(Fagopyrumcymosum)的離體快繁結(jié)合秋水仙堿誘導(dǎo)同源四倍體的試驗(yàn)中，分別選用無菌芽和愈傷組織作為誘導(dǎo)材料，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在相同的處理?xiàng)l件下愈傷組織的誘導(dǎo)率、存活率都明顯高于前者。因此，在組織培養(yǎng)結(jié)合秋水仙堿誘導(dǎo)培育植物多倍體的過程中，應(yīng)注意選取合適的誘導(dǎo)材料。5木本植物種間生長狀況的差異組織培養(yǎng)與秋水仙堿誘導(dǎo)相結(jié)合培育植物多倍體，可在短期內(nèi)對(duì)那些有價(jià)值的多倍體材料進(jìn)行大量的增殖，并能進(jìn)一步發(fā)揮組織培養(yǎng)的優(yōu)勢進(jìn)行工廠化生產(chǎn)，以滿足市場需求，因此，有著很好的應(yīng)用前景。通過組織培養(yǎng)與秋水仙堿誘導(dǎo)相結(jié)合的技術(shù)途徑成功培育植物多倍體的報(bào)道有草本植物的睡蓮(Nelumbonucifera)、芋類(Xanthosomasagittifolium)、姜類、黃花菜、黃瓜(Cucumissativus)、白菜(Brassicacampestris)、萵苣(Lactucasativa)、馬鈴薯(Solanumtuberosum)、辣椒、重瓣大巖桐(Sinningiaspeciosa)、百合(Liliumdavidii)、苧麻、蘆薈等；木本植物的茶屬(Camellia)、蘋果、獼猴桃、柿(Diospyroskaki)、桑樹(Morusalba)、巴西橡膠樹等?？傮w而言，草本植物較多，木本植物較少，主要原因是由于草本植物離體微繁體系建立比較容易，也較成熟；而木本植物除了楊樹、桉