利用蔗糖密度梯度離心法純化偽狂犬病毒

真菌病毒（prv）也被稱(chēng)為假性病毒（prv），屬于官僚病毒甲科植物。偽狂犬病是由偽狂犬病毒引起的家畜和多種野生動(dòng)物的一種以發(fā)熱、奇癢、呼吸和神經(jīng)系統(tǒng)疾病為特征的急性傳染病,又稱(chēng)Aujeszky病,在世界各地流行。偽狂犬病毒可引起豬、牛、羊、犬、貓、家兔、小白鼠、水貂、狐等多種家畜和野生動(dòng)物發(fā)病,具有高致死率。而豬是該病毒增殖感染唯一可存活的宿主,是該病毒的自然儲(chǔ)存庫(kù)。所以,從豬群中切斷偽狂犬病毒的傳播是控制偽狂犬病的有效途徑。到目前為止,已有24個(gè)省市先后報(bào)道該病,給我國(guó)養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。并且,豬感染偽狂犬病毒后,免疫系統(tǒng)受到損害,容易繼發(fā)感染其他疾病,如豬瘟、豬繁殖與呼吸障礙綜合征等,給豬偽狂犬病的防治增加了難度,也給豬病防治提出了新的課題。本研究純化并鑒定偽狂犬病毒,旨在為今后利用其建立雜交瘤細(xì)胞株,獲得偽狂犬病毒單克隆抗體以及建立特異的病原診斷方法奠定基礎(chǔ)。1材料和方法1.1低分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)Taq酶、基因組DNA提取試劑盒為大連寶生物工程有限公司產(chǎn)品;引物合成和序列測(cè)定由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成;低分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)為上海麗珠東風(fēng)生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品;犢牛血清購(gòu)自杭州四季青生物工程材料有限公司;偽狂犬病毒Bartha株購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥監(jiān)察所;HITACHICR-21GⅡ高速離心機(jī)、HITACHICP-100WX超速離心機(jī)、DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)英杰生命技術(shù)有限公司。1.2方法1.2.1狂犬病毒bartha的培養(yǎng)過(guò)程用含10%犢牛血清的DMEM培養(yǎng)幼倉(cāng)鼠腎細(xì)胞(BHK-21)使其生長(zhǎng)至單層后,接種適當(dāng)稀釋的偽狂犬病毒Bartha株1mL,于5%CO2、37℃條件下孵育1h后,每瓶加8~10mL含2%犢牛血清的DMEM維持液,培養(yǎng)60h后收獲。第1代無(wú)典型細(xì)胞病變,盲傳2代后,開(kāi)始出現(xiàn)典型的細(xì)胞病變,傳至21代,都出現(xiàn)典型的細(xì)胞病變。將BHK-21細(xì)胞培養(yǎng)物反復(fù)凍融3次后收集,置-20℃?zhèn)溆谩?.2.2基因組dna提取將病毒的細(xì)胞培養(yǎng)液反復(fù)凍融3次后,以5000r/min離心30min,取沉淀,按基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取DNA,-20℃保存?zhèn)溆谩?.2.3pcr擴(kuò)增過(guò)程根據(jù)參考文獻(xiàn)合成1對(duì)引物,上游引物P1:5′-CACGGAGGACGAGCT-GGGGCT-3′,下游引物P2:5′-GTCCACGCCCCGCT-TGAAGCT-3′,以提取的病毒DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增長(zhǎng)度為217bp。PCR反應(yīng)體系為20μL,循環(huán)參數(shù)為:94℃預(yù)變性4min;94℃1min,65℃1min,72℃1min,30個(gè)循環(huán);最后72℃延伸10min。擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。1.2.4設(shè)立2%微生物指標(biāo)將凍融的PRV細(xì)胞培養(yǎng)液做10倍系列稀釋,接種至已鋪滿單層BHK-21細(xì)胞的96孔培養(yǎng)板中,每稀釋度接種8孔,于5%CO2、37℃條件下吸附1h。最后3列作為對(duì)照組,每孔加0.1mLPBS。然后按0.1mL/孔加入2%犢牛血清的DMEM。于5%CO2、37℃條件下培養(yǎng)。每日觀察記錄細(xì)胞病變情況,144h后終判,按Karber法計(jì)算病毒滴度。1.3沉淀用微膠凝劑pbs細(xì)胞培養(yǎng)物于4℃下8000r/min離心30min,取上清,再在4℃下25000r/min離心2.5h,沉淀用少量0.01mol/LPBS(pH7.2)重懸。以PBS配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%、35%、40%、45%的不連續(xù)蔗糖梯度溶液,加樣品至梯度界面上,4℃、26000r/min離心2h,吸取蛋白帶至離心管內(nèi),加PBS以30000r/min離心1h去蔗糖,沉淀以PBS溶解,-80℃保存?zhèn)溆谩?.4病毒蛋白質(zhì)含量的測(cè)定利用752型紫外光柵分光光度儀(上海第三分析儀器廠),測(cè)定260nm和280nm波長(zhǎng)處病毒樣品的OD值。1.5直平板電泳將病毒樣品煮沸變性后,進(jìn)行SDS垂直平板電泳。60mA電壓下電泳約3h,用考馬斯亮藍(lán)R250染色2~4h。參照標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量蛋白遷移率,測(cè)算出病毒樣品電泳條帶對(duì)應(yīng)的分子質(zhì)量。2結(jié)果與分析2.1prv在brk細(xì)胞上的增殖培養(yǎng)BHK細(xì)胞接種PRV后,第1代細(xì)胞無(wú)特異性病變出現(xiàn),盲傳2代后,開(kāi)始出現(xiàn)特異性的細(xì)胞變圓、脫落,形成合胞體的病變(圖1)。這說(shuō)明PRV在BHK細(xì)胞中復(fù)制并增殖,對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)產(chǎn)生了特定的影響。由瓊脂糖凝膠電泳圖譜可見(jiàn),在217bp左右處出現(xiàn)1條與預(yù)期大小一致的條帶(圖2)。測(cè)序也證實(shí)待純化的細(xì)胞液中確實(shí)存在豬偽狂犬病毒。2.2稀釋度的確定Karber法計(jì)算病毒滴度公式為:lgTCID50=L-d(s-0.5),其中L=最高稀釋度的對(duì)數(shù);d=稀釋對(duì)數(shù)之間的差;s=陽(yáng)性管比率總和。根據(jù)表1中數(shù)據(jù),得lgTCID50=L-d(s-0.5)=-1-1×(1.75-0.5)=-2.25,病毒滴度為103.25TCID50/mL,所得病毒毒力偏低,可能是由于培養(yǎng)病毒時(shí)所加維持液偏多的緣故。2.3采后感染的豬偽狂犬病毒的細(xì)胞系統(tǒng)接毒的BHK-21細(xì)胞電泳條帶與未接毒細(xì)胞相比,在40kD附近出現(xiàn)了2條新增條帶(圖3),這2條帶在提純的病毒中依然存在。這表明在接毒后,細(xì)胞內(nèi)的蛋白組成已經(jīng)發(fā)生變化,這些新增的蛋白很可能是組成病毒的蛋白。提純病毒共出現(xiàn)5條蛋白帶,分子質(zhì)量為30~97kD,其蛋白大小與報(bào)道的豬偽狂犬病毒各蛋白大小基本相當(dāng)。由圖3可見(jiàn),經(jīng)蔗糖密度梯度離心后,病毒純度有明顯提高。3brk-21細(xì)胞增殖特點(diǎn)一般采用在低倍顯微鏡下觀察細(xì)胞病變來(lái)判斷病毒是否在細(xì)胞系中增殖。細(xì)胞病變是病毒在細(xì)胞內(nèi)增殖及其對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生損害的最明顯的表現(xiàn),包括胞漿的顆粒變性、胞核的變形和碎裂等,而且經(jīng)常導(dǎo)致細(xì)胞的完全破壞。細(xì)胞病變的出現(xiàn),一般可認(rèn)為是病毒增殖的確切證據(jù)。接毒BHK-21細(xì)胞出現(xiàn)了明顯的細(xì)胞變圓,脫落,形成合胞體的特異性病變。病毒樣品經(jīng)超速離心濃縮和蔗糖密度梯度離心后,每一界面均