木霉菌對甜瓜枯萎病的田間防效及防御酶系比的影響

近年來，隨著種植結(jié)構(gòu)的調(diào)整，保護和塑料大閥的面積也在增加。作為一種土壤傳統(tǒng)病，瓜氨酸腐爛病逐年惡化。正常年產(chǎn)量損失20%30%，嚴(yán)重年平均產(chǎn)量幾乎無效，已成為瓜氨酸生產(chǎn)的常見病。目前，對瓜類枯萎病的防治主要采用以嫁接防病為主，輔以化學(xué)防治，但甜瓜枯萎病菌以菌絲和孢子在土壤中越冬，其厚垣孢子在土壤中存活年限較長，且枯萎病菌一旦進入植株體內(nèi)藥劑防治相當(dāng)困難。隨著人們生態(tài)意識的不斷提高，對綠色食品、無公害產(chǎn)品的需求也越來越多。木霉菌以其繁殖速度快，適用性強，成為生物防治的熱點，國內(nèi)外已有報道,但對其防治機理研究的不多。本實驗室多年來對木霉菌防治瓜類枯萎病進行大量研究，本試驗即在此基礎(chǔ)上，對木霉菌防治甜瓜枯萎病的機理進行研究，為木霉菌的生物防治提供理論基礎(chǔ)。1材料和方法1.1木霉菌s13供試甜瓜品種為改良齊甜一號。生防菌株為木霉菌T23，由沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)生物農(nóng)藥工程中心提供。甜瓜枯萎病菌菌株-尖孢鐮孢菌分離自遼寧省錦州市太河區(qū)甜瓜枯萎病株。1.2防雨效果測定1.2.1接種菌培養(yǎng)物鐮刀菌放在玉米砂培養(yǎng)基中培養(yǎng)14d，木霉菌放在麥麩培養(yǎng)基中培養(yǎng)7d，風(fēng)干后粉碎備用。將木霉菌培養(yǎng)物與無菌土以1∶100比例混合，鐮刀菌培養(yǎng)物以0.5∶100混合，設(shè)接種鐮刀菌、同時接種木霉菌和鐮刀菌、不接菌（為對照）3個處理。每個處理3次重復(fù)。甜瓜種子經(jīng)表面消毒催芽后播種于直徑10cm的塑料盆中，每個處理50盆，每盆2粒種子，放置在玻璃溫室內(nèi)，于三葉期調(diào)查發(fā)病率。1.2.2木霉菌基土處理在甜瓜苗定殖期，將木霉菌培養(yǎng)物與田間土以1∶400比例混合，每穴施用100g，于甜瓜開花期再用水將木霉菌培養(yǎng)物稀釋500倍，每穴100mL灌根，以不拌藥和化學(xué)農(nóng)藥苗菌敵(30%多·?？蓾裥苑蹌?，齊齊哈爾四友化工有限公司生產(chǎn))1∶50拌土穴施作為對照。每個處理隨機種植3個小區(qū)，每小區(qū)6行，每行15株。于果實膨大期調(diào)查發(fā)病率。1.3防御反應(yīng)酶系統(tǒng)的測定1.3.1木霉菌對土壤中ze甜瓜種子經(jīng)55℃溫湯浸種30min后催芽，挑選長勢一致的發(fā)芽種子播種。培養(yǎng)待甜瓜長出3片真葉后，開始接菌。木霉菌的孢子濃度為5×106個·mL-1，鐮刀菌的孢子濃度為1×106個·mL-1。將孢子懸浮液用注射器注入根圍土壤，每穴10mL。共分4個處理：(1)只接鐮刀菌(F)；(2)接種木霉菌T23(T)；(3)先接種木霉菌T23,3d后接種鐮刀菌(T+F)；(4)不接菌（CK）。從接種前開始隔天取樣，直至接種后第7天。取根部樣品，自來水強力沖洗后，用濾紙吸干，裝入自封袋，放入-20℃低溫冰箱中保存。1.3.2酶的粗提取液的制備準(zhǔn)確稱取1g甜瓜根樣品，放入預(yù)冷的研缽中，加入1.5mL0.2M硼酸緩沖液（pH值8.8）及0.2g石英砂，冰浴中研磨成勻漿，轉(zhuǎn)移至離心管中，用1.5mL上述緩沖液沖洗研缽及缽棒2次合并入離心管，攪動20min后，10000r·min-1,離心20min，上清液即為酶的粗提取液。1.3.3酶活性的測定苯丙氨酸解氨酶（PAL）酶活性測定：以L-苯丙氨酸為底物，按許勇的方法，以每小時OD值變化0.01為一個酶活單位，用U·g-1FW表示酶活性；過氧化物酶（POD）酶活性測定：以愈創(chuàng)木酚為底物，用陳捷等的方法測定，以每分鐘OD值變化0.1為一個酶活單位，用U·g-1FW表示酶活性；多酚氧化酶（PPO）酶活性的測定,以鄰苯二酚為底物，按陳捷等的方法測定，以每分鐘OD398nm變化0.01為1個酶活單位，用U·g-1FW表示酶活性；β-1,3-葡聚糖酶（β-1,3-glucanase）比活性以葡聚糖為底物，按湯章城的測定方法，以每秒鐘產(chǎn)生還原糖1nmol為1個酶活單位，用U·g-1FW表示酶活性。1.3.4酶提取物及未知樣品蛋白含量的測定2結(jié)果與分析2.1木霉菌對甘蔗枯萎的預(yù)防2.1.1木霉菌對甘蔗枯萎的室內(nèi)治療效果從表1可以看出，使用木霉菌處理的甜瓜苗與單獨接種鐮刀菌處理的相比發(fā)病較遲，發(fā)病率低，相對防效在70%以上。2.1.2木霉菌對甘蔗枯萎的田間治療效果從表2可以看出，使用木霉菌可以有效的防治田間甜瓜枯萎病，防治效果明顯高于化學(xué)農(nóng)藥苗菌敵。2.2酶比活力的測定2.2.1接種木霉菌對3天酶活性的影響如圖1所示：接種鐮刀菌處理（F），酶活力始終低于空白對照，接種后第1天至第5天酶活力呈下降趨勢，第7天時有所回升。接種木霉菌處理（T），第3天酶活性達到峰值，較對照高出55.7%，之后酶活性緩慢下降，第7天接近對照。先接種木霉菌，3d后接種鐮刀菌處理（T+F），酶活性形成兩個活性高峰，第一個高峰出現(xiàn)在接種后第1天，峰值較低，為1495.14U·g-1FW；隨后，酶活性緩慢下降，至第7天形成第二個酶活性高峰，峰值為2515.08U·g-1FW，較對照高出138.7%?？梢婋S著時間的延長，接種木霉菌后再接種鐮刀菌能明顯誘導(dǎo)PAL酶活性的升高。2.2.2接種木霉菌、木內(nèi)桿菌活性如圖2所示：接種鐮刀菌處理（F），第1天至第5天酶活力始終低于空白對照，第3天酶活較對照下降228.6%，第7天形成酶活高峰，峰值為362.58U·g-1FW，高于對照。接種木霉菌處理（T），酶活始終高于空白對照，第3天和7天形成兩個酶活性高峰，峰值分別為354.18U·g-1FW和391.2U·g-1FW，稍高于對照。先接種木霉菌，3天后接種鐮刀菌處理（T+F），第1天出現(xiàn)第一酶活力高峰，活性明顯高于其他處理，峰值為574.62U·g-1FW,是對照的1.9倍，到第3天出現(xiàn)峰谷，之后酶活性緩慢上升，第7天出現(xiàn)第二個高峰，酶活性達到978.84U·g-1FW，是對照的8.87倍?？梢?，接種木霉菌后再接種鐮刀菌的處理，誘導(dǎo)產(chǎn)生的POD酶活性明顯高于其他處理。2.2.3接種木霉菌對7天酶活性的影響如圖3所示：只接鐮刀菌處理（F），第1天出現(xiàn)一個較大的酶活性高峰，峰值為760.85U·g-1FW，是對照的1.73倍，之后急速下降，第3天出現(xiàn)峰谷，酶活性低于對照31.2%，爾后酶活性緩慢上升，第7天出現(xiàn)第二個高峰。接種木霉菌處理（T），第1天出現(xiàn)酶活性高峰，峰值為702.42U·g-1FW，是對照的1.7倍，之后緩慢下降，第5天出現(xiàn)峰谷，第7天酶活性有所回升，再次出現(xiàn)高峰，但值小于第1天時，酶活性接近只接鐮刀菌處理。先接種木霉菌，3天后接種鐮刀菌處理（T+F），第1天和第5天酶活性稍高于空白對照，第3天出現(xiàn)峰谷，與只接鐮刀菌處理持平，之后酶活性開始上升，第7天酶活性上升幅度較大，明顯高于其他處理，高于對照183.9%，其峰值為833.1U·g-1FW。由圖3中可以看出，接種后第一天，鐮刀菌的誘導(dǎo)作用較強，隨著時間的延長，接種木霉菌后再接種尖孢鐮孢菌的處理的誘導(dǎo)作用呈現(xiàn)上升的趨勢。2.2.4不同接種木霉菌、尖孢鐮孢菌的酶活性如圖4所示：接種鐮刀菌處理（F），第5天出現(xiàn)一個明顯的酶活性高峰，峰值為36.11U·g-1FW。接種木霉菌處理（T），第3天出現(xiàn)一個小峰，峰值為47.22U·g-1FW，第7天達到酶活性高峰（64.33U·g-1FW），是對照的2.46倍。先接種木霉菌再接種尖孢鐮孢菌的處理（T+F），酶活性呈逐漸上升的趨勢，峰值較低，為46.39U·g-1FW，是對照的1.59倍。由圖4中可以看出，接種木霉菌后再挑戰(zhàn)接種鐮刀菌的處理和單獨接種木霉菌的處理均能明顯誘導(dǎo)β-1,3-葡聚糖酶活性的增強。3結(jié)論和討論3.1木霉菌在甜瓜枯渙病治療中的應(yīng)用應(yīng)用木霉菌對土傳病害的研究國內(nèi)外雖有很多報道，但在實際應(yīng)用過程中防治效果都不是十分理想。本研究利用木霉菌T23防治甜瓜枯萎病的相對防治效果達到79.00%，主要是選擇了木霉菌用于生物防治的最適使用方法及使用量，為木霉菌生存及定殖提供理想的環(huán)境條件，進而在其與病菌競爭中處于優(yōu)勢地位。本研究證實將木霉菌通過穴施和灌根相結(jié)合的方法施用，對枯萎病可取得理想的防效。3.2木霉菌對植物致病性的影響植物受到病原物侵染后，其反應(yīng)相當(dāng)復(fù)雜，植物-病原物的互作或者植物對病原物入侵生理反應(yīng)的最基本原因是酶的催化作用。PAL是酚類物質(zhì)、植保素和木質(zhì)素合成的關(guān)鍵酶，植物在受到病原菌侵染或激發(fā)子刺激后PAL活性會首先上升。POD催化脂肪族、芳香族和酚類物質(zhì)的氧化，是木質(zhì)素合成的關(guān)鍵酶之一，其活性的增加，標(biāo)志著木質(zhì)素的加速合成和植物抗性的產(chǎn)生。PPO能將酚類物質(zhì)氧化成對病菌有毒的醌類物質(zhì)。幾丁質(zhì)是植物病原菌細(xì)胞壁的主要成分之一，在體外病原和非病原真菌生長尤其是菌絲尖部最易受到幾丁質(zhì)酶和β-1,3-葡聚糖酶的降解。因此，通過研究寄主防御酶系的活性變化可間接反應(yīng)植物的抗病性水平。本研究結(jié)果表明：先接種木霉菌再接種鐮刀菌處理的PAL、POD、PPO酶活性顯著高于其他處理，且變化趨勢基本相同，第1天出現(xiàn)一個酶活性小高峰，第7天達到酶活性高峰，這與前人的研究結(jié)果相一致。在防御酶活性的增長速度上，從第5天迅速上升，到第7天達到峰值。其原因可能是木霉菌處理甜瓜后激活了寄主植物防御酶系或?qū)χ参锲鸬矫艋饔?，?dāng)接種病原菌后，進一步激發(fā)了防御酶的防衛(wèi)反應(yīng)，從而酶的活性明顯高于其他處理。當(dāng)然，這種類似于協(xié)同的激發(fā)作用很復(fù)雜，并不是一個簡單的疊加作用。β-1,3-葡聚糖酶