瓜子金皂苷己對(duì)氧糖剝奪復(fù)供誘導(dǎo)的pc12細(xì)胞凋亡的影響

瓜子金配合素是從遠(yuǎn)志綜合征中分離出來(lái)的一醇噸三醇單體。體內(nèi)試驗(yàn)表明，它具有抗抑郁、鎮(zhèn)靜、焦慮和催眠的作用。最新報(bào)道PGSF對(duì)MPP+(1-methyl-4-phenylpyridinium)所致PC12細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用,可通過(guò)促進(jìn)大鼠海馬齒狀回突觸傳遞發(fā)揮促智功能。提示PGSF可能具備廣泛的神經(jīng)保護(hù)作用。本研究旨在探討PGSF對(duì)氧糖剝奪/復(fù)供(oxygen-glucosedeprivationandreperfusion,OGD/R)模擬缺血/再灌注損傷所致的PC12細(xì)胞凋亡有無(wú)保護(hù)作用,作用機(jī)制如何。1材料表面1.1表面活性劑和檢測(cè)試劑PGSF由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所合成室提供,二甲基亞砜(dimethylsulfoxide,DMSO)溶解備用;AnnexinV-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、線(xiàn)粒體膜電位檢測(cè)試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所);Bcl-2和Bax一抗(美國(guó)SantaCruz);ECL發(fā)光試劑(北京普利萊公司);DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、馬血清(美國(guó)Gibco公司);Hochest33342、碘化丙啶(propidiumiodide,PI)、β-actin抗體(美國(guó)Sigma公司);PVDF膜(美國(guó)Millipore公司);BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(北京Vigorous公司);連二亞硫酸鈉(sodiumdithionite,Na2S2O4)及其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。1.2細(xì)胞植物1.3化學(xué)成分檢測(cè)ThermoScientificMultiskanFC酶標(biāo)儀(美國(guó)賽默飛世爾公司);BDFACSCalibur流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司);LAS-3000化學(xué)發(fā)光及影像分析儀(日本富士);RCM8000型熒光顯微鏡(日本Nikon)。2方法2.1體外氧糖剝奪法檢測(cè)bmscsPC12細(xì)胞用含5%胎牛血清和5%馬血清的DMEM培養(yǎng)基常規(guī)傳代培養(yǎng),在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期以5×104個(gè)/孔接種于6孔培養(yǎng)板培養(yǎng)24h,用于分組處理。造模細(xì)胞用含10mmol·L-1Na2S2O4的無(wú)糖Earle’s液孵育4h作為氧糖剝奪處理,然后換為完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h作為復(fù)氧復(fù)糖處理。實(shí)驗(yàn)分組:正常對(duì)照組、OGD/R模型組、OGD/R+PGSF(10.00、1.00、0.10μmol·L-1)組。給藥組在氧糖剝奪過(guò)程的Earle’s液和復(fù)氧復(fù)糖過(guò)程的完全培養(yǎng)基中都加入相應(yīng)藥物。2.2熒光顯微鏡測(cè)定造模及給藥后,PC12細(xì)胞用4%多聚甲醛溶液固定,加入終濃度各為10μmol·L-1的Hoechst33342和PI,避光染色20min,PBS漂洗兩次,在熒光顯微鏡下觀察拍照并計(jì)數(shù)。2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞系統(tǒng)中樣品經(jīng)OGD/R處理后,收集細(xì)胞培養(yǎng)液,用胰酶消化并吹下貼壁細(xì)胞,合并細(xì)胞懸液,2000r·min-1離心5min,棄上清,按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行AnnexinV和PI染色,隨即上機(jī)進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè),每個(gè)樣品計(jì)數(shù)10000個(gè)細(xì)胞。AnnexinV-FITC染色陽(yáng)性為綠色熒光,PI染色陽(yáng)性為紅色熒光。2.4熒光顯微鏡照片(mitochondrialmembranepotential,MMP)造模結(jié)束后,用PBS漂洗細(xì)胞1次,然后加入PBS溶解的10μmol·L-1JC-1,37℃、5%CO2培養(yǎng)箱負(fù)載20min,PBS漂洗后于熒光顯微鏡下拍照。2.5細(xì)胞裂解蛋白定量的測(cè)定造模及藥物處理結(jié)束后,棄上清,收集細(xì)胞,4℃,2500r·min-1離心5min,取沉淀,經(jīng)PBS漂洗后,加入細(xì)胞裂解緩沖液100μl,冰浴30min,收集細(xì)胞裂解液,12000r·min-1離心30min,取上清用BSA法進(jìn)行蛋白定量。每組取蛋白樣品10μg上樣,經(jīng)10%聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,3%BSA室溫封閉2h,加一抗于4℃孵育過(guò)夜,TBST洗膜后,加相應(yīng)二抗室溫孵育2h,ECL顯色,化學(xué)發(fā)光儀成像。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。2.6組間比較分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以u(píng)e0af±s表示,以SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。組間比較用單因素方差分析(one-wayANOVA)。用Gel-Pro3.2軟件對(duì)Westernblot實(shí)驗(yàn)條帶進(jìn)行灰度掃描和分析。3結(jié)果3.1晚期凋亡或死細(xì)胞被破壞的細(xì)胞正常對(duì)照組細(xì)胞核被Hoechst33342著染后呈均勻藍(lán)色熒光;凋亡細(xì)胞核因染色質(zhì)凝聚呈現(xiàn)不均勻強(qiáng)藍(lán)色熒光,或因核碎裂出現(xiàn)凋亡小體;晚期凋亡或壞死細(xì)胞因?yàn)榧?xì)胞膜被破壞,細(xì)胞核被PI著染而呈強(qiáng)紅色熒光。OGD/R組紅色熒光細(xì)胞較正常組明顯增多,說(shuō)明大量細(xì)胞死亡;PGSF各劑量組紅色熒光細(xì)胞都明顯少于模型組,染色質(zhì)凝聚及細(xì)胞核碎裂現(xiàn)象減少,表明PGSF可明顯減少OGD/R處理細(xì)胞的晚期凋亡或壞死數(shù)量。見(jiàn)Fig1及Tab1。3.2減少細(xì)胞凋亡/死率流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示,PGSF主要影響細(xì)胞晚期凋亡/壞死百分率。OGD/R處理使細(xì)胞晚期凋亡/壞死率由正常對(duì)照組的4.04%增至28.24%,PGSF10.00、1.00、0.10μmol·L-1可分別使細(xì)胞晚期凋亡/壞死率降低至10.07%、10.42%、16.74%。再次驗(yàn)證了PGSF對(duì)OGD/R處理PC12細(xì)胞具有保護(hù)作用,且其作用具有濃度依賴(lài)性。3.3pgsf-pbd/r檢測(cè)細(xì)胞線(xiàn)蟲(chóng)膜電位,將火炬放空在體內(nèi)表達(dá),結(jié)果顯示:正常組細(xì)胞被激發(fā)后多數(shù)呈紅色熒光,線(xiàn)粒體膜電位正常,呈綠色熒光細(xì)胞僅占(4.6±0.1)%;OGD/R處理可使(82.8±3.1)%的細(xì)胞呈綠色熒光,說(shuō)明多數(shù)細(xì)胞線(xiàn)粒體膜電位降低,與正常組差異具有顯著性(P<0.01)。PGSF10.00、1.00、0.10μmol·L-1組呈綠色熒光細(xì)胞分別占(17.7±1.4)%、(24.4±3.4)%和(59.3±5.6)%,與OGD/R組比較明顯減少(P<0.01,P<0.01,P<0.05),說(shuō)明PGSF可濃度依賴(lài)性地抑制OGD/R引起的線(xiàn)粒體膜電位的降低。見(jiàn)Fig2。3.4細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白由Fig3可見(jiàn),與正常對(duì)照組相比,OGD/R可使PC12細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2/Bax比值明顯降低;PGSF10.00、1.00、0.10μmol·L-1分別使Bcl-2/Bax比值回升至模型組的2.6倍、2.4倍和2.3倍。4pgsf調(diào)控caspase-1的機(jī)制腦缺血后盡快恢復(fù)血流是防治缺血損傷的最有效措施,然而再灌注損傷會(huì)使腦功能出現(xiàn)更加嚴(yán)重的障礙。在缺血性腦損傷中神經(jīng)細(xì)胞表現(xiàn)出壞死和凋亡兩種死亡形式,抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡的發(fā)生是治療缺血性腦血管病的重要著眼點(diǎn)。PC12細(xì)胞是大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞,具有很多神經(jīng)細(xì)胞的特性,常代替神經(jīng)細(xì)胞用于研究。Na2S2O4為氧清除劑,起效迅速且不損傷細(xì)胞膜。Na2S2O4合并低糖常被用來(lái)構(gòu)建簡(jiǎn)單安全的的低氧低糖模型以用于實(shí)驗(yàn)研究。本課題以此模型為基礎(chǔ)模擬腦缺血/再灌注損傷,從多個(gè)角度證明了PGSF對(duì)OGD/R處理的PC12細(xì)胞具有明顯的保護(hù)作用。目前尚未見(jiàn)到其它關(guān)于PGSF對(duì)缺血/再灌損傷的作用方面的研究報(bào)道。線(xiàn)粒體是細(xì)胞的產(chǎn)能供能中心,正常的MMP是維持線(xiàn)粒體功能所必需的。MMP下降是細(xì)胞凋亡過(guò)程中的早期事件,是凋亡的特異性改變。OGD/R等因素可使線(xiàn)粒體內(nèi)外膜交界處存在的線(xiàn)粒體通透性轉(zhuǎn)換孔以高通透構(gòu)象持續(xù)性開(kāi)放,膜間隙正離子不斷進(jìn)入基質(zhì),致使內(nèi)膜兩側(cè)電勢(shì)差減少,MMP下降或消失,線(xiàn)粒體腫脹,功能受損,細(xì)胞色素C等凋亡相關(guān)分子釋放到胞質(zhì),最終激活Caspase家族成員介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。JC-1能滲透到細(xì)胞器內(nèi)并與線(xiàn)粒體特異性結(jié)合,目前作為檢測(cè)MMP最好的熒光染料而被廣泛應(yīng)用。在MMP較低時(shí),JC-1以單體存在于胞質(zhì),MMP較高時(shí),JC-1形成聚合物聚集在線(xiàn)粒體基質(zhì)中,被激發(fā)后分別產(chǎn)生綠色和紅色熒光。在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞顏色即可判斷MMP的變化。Bcl-2家族成員在細(xì)胞凋亡的調(diào)控過(guò)程中發(fā)揮重要作用,并與MMP的改變存在密切關(guān)系。文獻(xiàn)報(bào)道,抗凋亡蛋白Bcl-2可能通過(guò)保持線(xiàn)粒體內(nèi)、外膜的完整性以及增加線(xiàn)粒體基質(zhì)內(nèi)質(zhì)子的外流而抑制MMP的下降,還可通過(guò)與caspase-9等形成復(fù)合物而抑制caspase-3的激活。相反,促凋亡蛋白Bax等可轉(zhuǎn)位至線(xiàn)粒體而促進(jìn)線(xiàn)粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開(kāi)放,誘導(dǎo)凋亡。最終,Bcl-2和Bax通過(guò)影響細(xì)胞色素C的釋放而抑制或促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Bcl-2還可與Bax形成異源二聚體,抑制Bax的促凋亡效應(yīng),Bcl-2和Bax二者的比例對(duì)