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文檔簡介

實驗二半定量RT-PCR分析擬南芥葉片PPH基因表達田亞楠實驗目的1、了解植物葉綠素酶基因的功能2、掌握半定量RT-PCR操作方法3、掌握基因定量分析的方法實驗原理

RT-PCR(ReverseTranscription-PolymeraseChainReaction)是以RNA為模板，在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，由人工合成引物介導生成cDNA第一鏈，以此再作為聚合酶鏈反應的模板，在TaqDNA聚合酶作用下，擴增產(chǎn)生大量DNA片斷。該方法理論上有一個單拷貝cDNA模板即可完成擴增，因此它比較適合作基因表達的定量研究，是一種常用的具有很高靈敏度和特異性的基因表達檢測方法。RT-PCR方法有定量RT-PCR和半定量RT-PCR法，定量PCR法對實驗儀器和樣本處理的要求較高，而半定量PCR法對試驗條件的要求不高，它的主要特點是選擇一個比較標準(control)又稱為內(nèi)參基因，以消除試驗誤差，樣本間用于比較的值不是絕對值，而是相對值，因此稱半定量RT-PCR法。內(nèi)參基因的設定為了保證實驗結(jié)果的可靠與準確，可在PCR擴增目的基因時，加入一對內(nèi)參照基因的特異性引物，同時擴增內(nèi)參DNA，作為對照。常用的內(nèi)參有GAPDH（3-磷酸甘油醛脫氫酶）、β-Actin（β-肌動蛋白）、UBQ（泛蛋白）等。其目的在于避免RNA定量誤差、加樣誤差以及各PCR反應體系中擴

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