不同植物激素對(duì)馬鈴薯愈傷組織誘導(dǎo)及其再生體系的影響

甘薯是世界上最重要的糧食。我國(guó)馬鈴薯種植面積位列世界第一,但我國(guó)馬鈴薯單產(chǎn)低于世界平均水平,如何提高馬鈴薯品質(zhì)和產(chǎn)量有著重大意義?，F(xiàn)有馬鈴薯栽培品種由于遺傳背景狹窄,導(dǎo)致通過常規(guī)育種技術(shù)選育出滿足多種用途的品種較難。自1983年首次獲得轉(zhuǎn)基因馬鈴薯以來,短短10余年間,植物基因工程的研究和開發(fā)進(jìn)展十分迅速。轉(zhuǎn)基因技術(shù)的應(yīng)用克服了馬鈴薯常規(guī)育種的不足,為培育具有多種用途,如抗病、高產(chǎn)等新品種提供了可能。在植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)中,存在著植株再生率低的問題,但由于馬鈴薯不同基因型之間誘導(dǎo)再生條件存在較大的差異。李鳳云等研究10個(gè)馬鈴薯品種無腋芽莖段的愈傷誘導(dǎo)和再生情況發(fā)現(xiàn),品種間的差異達(dá)極顯著水平,愈傷組織誘導(dǎo)率最低為38.0%,最高為98.7%,再生率最高達(dá)到90.3%,最低只有2.1%;且不同品種誘導(dǎo)出的愈傷組織在質(zhì)地、大小、顏色、生長(zhǎng)速度等方面有很大差異,再生過程中芽點(diǎn)數(shù)及再生植株的生長(zhǎng)狀況也不盡相同。蔣敏華等比較了4個(gè)馬鈴薯品種的愈傷誘導(dǎo)率和芽分化率,愈傷誘導(dǎo)最高達(dá)64.77%,最低只有27.78%,芽誘導(dǎo)率最高為費(fèi)烏瑞它,達(dá)到11.54%,最低為中薯3號(hào),沒有出芽。不同品種間如此大的差異使得對(duì)不同品種進(jìn)行再生系統(tǒng)的篩選具有重要的意義。本研究通過對(duì)2個(gè)馬鈴薯品種(夏坡蒂和費(fèi)烏瑞它)的愈傷和出芽培養(yǎng)基進(jìn)行篩選,優(yōu)化了最佳激素配方,為進(jìn)一步轉(zhuǎn)基因工作奠定了基礎(chǔ)。1材料和方法1.1為材料的無菌苗研究以馬鈴薯品種夏波蒂(Solanumtuberosumcv.Shepody)和費(fèi)烏瑞它(Solanumtuberosumcv.Favorite)的無菌苗為材料(貴州省生物技術(shù)研究所提供)。無菌苗繼代培養(yǎng)于MS固體培養(yǎng)基中,取其莖段為外植體材料。1.2方法1.2.1誘導(dǎo)培養(yǎng)基的設(shè)計(jì)以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基,含3%蔗糖和0.8%瓊脂,pH為5.8,121℃高壓滅菌22min后,待培養(yǎng)基冷至50~60℃時(shí)加入過濾滅菌的玉米素并倒在平皿上,3~7d后無污染即可使用。夏坡蒂愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基采用3因素3水平L9(34)的正交設(shè)計(jì)試驗(yàn),3個(gè)因素分別為6-BA、NAA、GA3,其激素組合編號(hào)為A(表1),夏坡蒂的不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基激素組合編號(hào)為B(表2);在夏坡蒂愈傷和不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基篩選的基礎(chǔ)上對(duì)費(fèi)烏瑞它進(jìn)行愈傷和出芽培養(yǎng)基篩選,費(fèi)烏瑞它的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基編號(hào)為C(表1),不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基的編號(hào)為D(表2)。各處理的水平見表1和表2。1.2.2馬鈴薯芽分率檢測(cè)在超凈工作臺(tái)上,取生長(zhǎng)健壯苗齡為21~28d的無菌試管苗,選取馬鈴薯的幼嫩莖段作為外植體進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo),切成約0.5cm長(zhǎng)的莖段,除去葉片、腋芽及莖尖,留取莖部接種于不同處理的培養(yǎng)基上,培養(yǎng)基為不同濃度的激素組合,14d后統(tǒng)計(jì)愈傷數(shù),并觀察愈傷狀態(tài)。篩選出最優(yōu)激素組合后接種馬鈴薯莖段外植體進(jìn)行愈傷培養(yǎng),愈傷長(zhǎng)成后分別轉(zhuǎn)到芽分化培養(yǎng)基上,20~40d后統(tǒng)計(jì)芽分化率,愈傷率/%=愈傷外植體/總外植體數(shù)。芽分化率/%=分化芽數(shù)/總外植體數(shù)。愈傷誘導(dǎo)時(shí)每個(gè)品種每次處理約為90個(gè)外植體數(shù),重復(fù)3次。1.2.3培訓(xùn)條件試驗(yàn)材料均置于光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。光照強(qiáng)度為22000lx,光周期為12h光照/12h黑暗,培養(yǎng)溫度白天24℃,夜晚22℃。2結(jié)果與分析2.1受傷因素和芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基的篩選2.1.1最佳愈傷培養(yǎng)基的確定從表1看出,夏坡蒂在激素組合A6中,即2mg/L6-BA+0.5mg/LNAA+0.5mg/LGA3時(shí),愈傷率達(dá)到100%,同時(shí)愈傷比較大,顏色鮮綠色,長(zhǎng)勢(shì)均一,態(tài)勢(shì)好,故其為夏坡蒂的最佳愈傷培養(yǎng)基。在其他激素組合處理中,發(fā)現(xiàn):GA3在5mg/L和10mg/L的處理中,均出現(xiàn)出芽率比較高的態(tài)勢(shì),且影響其愈傷組織的生成。說明,過高的GA3濃度有促進(jìn)出芽的作用,但同時(shí)抑制了愈傷組織的生成。從不同激素組合下夏坡蒂的出芽率(表2)看出,夏坡蒂在愈傷組織培養(yǎng)14d后轉(zhuǎn)到出芽培養(yǎng)基上進(jìn)行出芽篩選,18d開始長(zhǎng)芽,在組合B5中,長(zhǎng)芽多,分化早,且芽誘導(dǎo)率高。綜合各個(gè)組合的出芽效果,觀察到在玉米素濃度為2mg/L的組合中,其芽分化早,且芽誘導(dǎo)率相對(duì)高,芽狀態(tài)好。這些結(jié)果說明,玉米素(ZT)在夏坡蒂不定芽誘導(dǎo)過程中有一定的作用。2.1.2培養(yǎng)基的選擇雖然費(fèi)烏瑞它在組合C1、C4、C5中的愈傷率都達(dá)到100%,但在C5上其愈傷組織為最佳狀態(tài),愈傷組織大,且其表面多為顆粒狀愈傷,有利于植株的再生,故選擇C5為其最佳愈傷培養(yǎng)基,同時(shí)也得出過高的NAA濃度不利于其愈傷的形成。費(fèi)烏瑞它出芽率在2mg/LZT+2mg/L6-BA+5mg/LGA3處理組合中最高,達(dá)到53.6%。同時(shí)觀察到,在含有2mg/L玉米素的培養(yǎng)基中出芽狀態(tài)普遍較好,愈傷組織大。由此得出,玉米素(ZT)有利于費(fèi)烏瑞它的愈傷和不定芽誘導(dǎo)。2.2再生馬鈴薯苗的確定將分化出的不定芽切割下來直接培養(yǎng)在不含任何激素的MS固體培養(yǎng)基中進(jìn)行根的誘導(dǎo),7d左右可觀察到根的發(fā)生,2個(gè)馬鈴薯品種不定芽誘導(dǎo)生根率均為100%,當(dāng)芽苗長(zhǎng)出7~8條根時(shí),將發(fā)育良好的再生苗從培養(yǎng)瓶中取出,沖去附著的培養(yǎng)基并移栽于盛有經(jīng)消毒處理的營(yíng)養(yǎng)土中,加蓋塑料膜保溫保濕,5~7d后揭去塑料薄膜,定期澆水,煉苗。移栽結(jié)果表明,兩品種移栽成活率均可達(dá)95%以上。3誘導(dǎo)率1)本研究參考前人研究的培養(yǎng)基配方進(jìn)行試驗(yàn),對(duì)夏坡蒂和費(fèi)烏瑞它的愈傷組織誘導(dǎo)和不定芽培養(yǎng)基進(jìn)行了探討。結(jié)果表明,夏坡蒂和費(fèi)烏瑞它的最佳愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基分別為MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.5mg/L+GA30.5mg/L和MS+ZT2.0mg/L+NAA0.1mg/L+GA30.5mg/L,誘導(dǎo)率均達(dá)100%。夏坡蒂和費(fèi)烏瑞它不定芽的最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基分別為MS+ZT2.0mg/L+NAA0.1mg/L+GA35mg/L和MS+6-BA2.0mg/L+ZT2.0mg/L+GA35mg/L,誘導(dǎo)率分別達(dá)到52.38%和53.6%。結(jié)果同時(shí)表明,玉米素有助于費(fèi)烏瑞它的愈傷和不定芽誘導(dǎo),與張寧等的報(bào)道相符,但其結(jié)果也存在一定的差異。在夏坡蒂愈傷和芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基篩選的基礎(chǔ)上對(duì)費(fèi)烏瑞它進(jìn)行愈傷和出芽篩選,結(jié)果發(fā)現(xiàn),費(fèi)烏瑞它的愈傷率普遍較高。說明,不同馬鈴薯品種間的激素組合有一定的相關(guān)性,應(yīng)用上可以起到互相指導(dǎo)的作用,減少篩選工作量,但費(fèi)烏瑞它的最佳激素組合不同于夏坡蒂,進(jìn)一步分析夏坡蒂分別在費(fèi)烏瑞它的最佳培養(yǎng)基C5和D3中的愈傷率和出芽率為81.5%和13.2%,而篩選的夏坡蒂最佳愈傷及不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基的效率則為100%和52.38%。比較夏坡蒂和費(fèi)烏瑞它的愈傷情況發(fā)現(xiàn),夏坡蒂的愈傷時(shí)間及生芽時(shí)間都比費(fèi)烏瑞它短,且它們的最佳愈傷激素組合濃度也不同。說明,不同品種間基因型差異對(duì)其再生所需激素組合及再生狀況都存在一定的影響。試驗(yàn)過程中還發(fā)現(xiàn),取材部位對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)有著一定的影響,取健壯植株莖的基部、中部、上部分別接種到相同的培養(yǎng)基上,在相同的培養(yǎng)條件下進(jìn)行培養(yǎng),結(jié)果發(fā)現(xiàn),取莖段中部進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo),出現(xiàn)愈傷較早,并且愈傷形成量較多,愈傷長(zhǎng)勢(shì)較好;取莖段基部進(jìn)