紅藻氨酸快速阻燃癲癇大鼠行為學(xué)、腦電圖和海馬病理改變

建立動(dòng)物癲癇模型是人類癲癇發(fā)病機(jī)制的最流行方法是獲取相關(guān)信息。最常用的動(dòng)物模型如最大電休克模型、戊四氮模型、士的寧模型等,嚴(yán)格說來只是癇性發(fā)作模型而不是癲癇模型。點(diǎn)燃模型的實(shí)驗(yàn)成功,提供了迄今為止最理想的人類癲癇模型。但常規(guī)的點(diǎn)燃模型需較長時(shí)間才能建立,不利于目前的科研需要,因此,如何在短期內(nèi)建立理想、穩(wěn)定的點(diǎn)燃模型,更好地應(yīng)用于癲癇發(fā)病機(jī)制的探索,進(jìn)行快速點(diǎn)燃模型的研究就顯得十分必要。目前關(guān)于采用紅藻氨酸(kainicacid,KA)建立快速點(diǎn)燃模型的研究,鮮有報(bào)道。鑒此,本實(shí)驗(yàn)采用立體定向技術(shù)KA作為化學(xué)致痙劑。在大鼠側(cè)腦室連續(xù)注射亞驚厥劑量的KA以誘發(fā)癲癇發(fā)作建立快速點(diǎn)燃模型,對(duì)大鼠顳葉癲癇(temporallobeepilepsy,TLE)的建立方法及行為學(xué)、腦電活動(dòng)、海馬病理改變和神經(jīng)發(fā)生進(jìn)行研究,現(xiàn)報(bào)告如下。1材料和方法1.1動(dòng)物腦電roSprague-Dawley(SD)雄性2月齡大鼠32只,體質(zhì)量200~250g,由本校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。飼養(yǎng)在12h晝夜循環(huán)光照恒溫的動(dòng)物室,自由進(jìn)食和水至少1周。實(shí)驗(yàn)設(shè)TLE模型組(實(shí)驗(yàn)組,n=24)與對(duì)照組(n=8)。KA為Sigma公司產(chǎn)品,用生理鹽水配成0.4μg/μl溶液,用前2h新鮮配制;立體定向儀為江灣Ⅰ型C動(dòng)物立體定向儀;深部電極描記采用由成都儀器廠生產(chǎn)的RM6240BD型多道生理信號(hào)采集處理系統(tǒng)記錄并分析。5-溴脫氧尿核苷(5-bromo-2’-deoxyuridine,BrdU)及小鼠抗BrdU抗體均為Sigma公司產(chǎn)品。SABC免疫組化試劑盒、DAB試劑盒為武漢博士德公司產(chǎn)品。組織切片制作:BrdU溶于無菌生理鹽水中,終濃度為10mg/ml。大鼠處死前2d進(jìn)行腹腔注射,100mg/kg,2次/d、間隔4h,注射2d共4次,最后1次BrdU注射后24h處死動(dòng)物。常規(guī)麻醉、灌注、固定、斷頭取腦、冰凍切片,片厚40μm。待BrdU免疫組化染色用。1.2方法1.2.1癲癇發(fā)作試驗(yàn)大鼠麻醉后,固定在立體定向儀上,選擇右側(cè)側(cè)腦室為靶點(diǎn),具體定位參考包新民等編著的《大鼠腦立體定位圖譜》,置入不銹鋼導(dǎo)管(外徑0.7mm,內(nèi)徑0.4mm),常規(guī)肌注3d青霉素,以牙托粉+502膠固定于顱骨上,術(shù)后7d開始試驗(yàn)。進(jìn)行腦內(nèi)注射時(shí),將清醒大鼠固定于敞式裝置上,在埋植的導(dǎo)管內(nèi)插入注射內(nèi)管,其下端超出套管0.5mm,另一端經(jīng)塑料管與微量進(jìn)樣器連接,將KA1μl(濃度為0.4μg/μl)注射入側(cè)腦室內(nèi),注射時(shí)間不少于10min。每天1次,連續(xù)5d,每次給藥均在8:00~10:00進(jìn)行。停止給藥后1周,再以KA相同劑量測試癲癇發(fā)作情況。對(duì)照組在右側(cè)側(cè)腦室內(nèi)注射相同容量的生理鹽水,其他均與實(shí)驗(yàn)組相同。做預(yù)實(shí)驗(yàn)時(shí),曾注入20g/L滂胺天藍(lán)(pontamineskyblue),核對(duì)給藥部位。1.2.2腦電活動(dòng)測定在埋植不銹鋼導(dǎo)管的同時(shí),雙側(cè)置入深部電極針,其靶點(diǎn):海馬CA3區(qū)、杏仁核內(nèi)的中心點(diǎn)、前額葉皮質(zhì)。通過計(jì)算機(jī)對(duì)腦電活動(dòng)和大鼠行為學(xué)表現(xiàn)連續(xù)記錄2h。注藥后6、12h、1d、1、2、3、4、6、8、12周,每次抓取2只大鼠,對(duì)海馬、杏仁核、前額葉皮質(zhì)進(jìn)行腦電描記。在對(duì)照組以相同的方法進(jìn)行腦電描記。電極位置在實(shí)驗(yàn)后均經(jīng)組織學(xué)證實(shí)無誤。1.2.3tle發(fā)作分級(jí)視頻攝像機(jī)監(jiān)視大鼠行為學(xué)變化,根據(jù)Racine分級(jí),大鼠TLE發(fā)作分為6級(jí),即0、Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ級(jí)。出現(xiàn)Ⅳ級(jí)或Ⅴ級(jí)癇性行為也稱為充分點(diǎn)燃。充分點(diǎn)燃后,在停止給藥后4周,再用KA相同劑量測試,以觀察大鼠是否仍保持其癲癇點(diǎn)燃狀態(tài)。1.2.4海馬病理變化的觀察在連續(xù)注射KA停止后1、2、3、4、8、12周每次抓取3只有癲癇發(fā)作的大鼠,經(jīng)麻醉灌注后斷頭取腦,Nissl染色后在顯微鏡下觀察海馬的病理變化。1.2.5后常規(guī)脫水、透明、封片按操作說明書進(jìn)行,DAB顯色。顯色后常規(guī)脫水、透明和封片。替代實(shí)驗(yàn),以正常山羊血清封閉液和0.01mol/LPBS代替一抗孵育切片。1.3統(tǒng)計(jì)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用xˉ±sxˉ±s表示,運(yùn)用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件行單因素方差分析。2結(jié)果2.1肌陣肌性發(fā)作實(shí)驗(yàn)組大鼠在反復(fù)小劑量KA注射的過程中,逐漸出現(xiàn)凝視、點(diǎn)頭、面部及頭部抽搐、全身肌陣攣、跌倒,大、小便失禁及流涎,最終發(fā)生全身強(qiáng)直-陣攣性發(fā)作、癲癇持續(xù)狀態(tài)。每次注射KA后2~4min內(nèi),大鼠出現(xiàn)凝視、不動(dòng),呈陣發(fā)性。6~8min內(nèi)偶爾出現(xiàn)面部肌肉和前肢的抽動(dòng),以注藥對(duì)側(cè)肢體為主,向左側(cè)翻滾轉(zhuǎn)圈。10~13min內(nèi)面部肌肉抽搐增多時(shí)間延長,有濕狗樣抖動(dòng)等動(dòng)作。1~6h內(nèi)有眨眼、刻板點(diǎn)頭、立須、咀嚼、流涎、豎尾巴等自動(dòng)癥出現(xiàn),前肢抽動(dòng)由單側(cè)為主發(fā)展到雙側(cè),并且還有全身肌陣攣,最終發(fā)展為全身性強(qiáng)直-陣攣性發(fā)作,大、小便失禁,隨后出現(xiàn)站立跌倒等,約5~10min發(fā)作1次,每次持續(xù)30s至2min。6~12h內(nèi)上述發(fā)作次數(shù)減少,程度減輕,主要為雙側(cè)前肢和面部肌肉抽搐、咀嚼、流涎。12~24h內(nèi),每1~2小時(shí)可觀察到單側(cè)肢體和面部肌肉抽搐或點(diǎn)頭等動(dòng)作,每次發(fā)作數(shù)秒。第6天開始,停止給藥,每天仍可觀察到流涎、身體旋轉(zhuǎn)、站立跌倒、間斷性地四肢強(qiáng)直抽搐,每次持續(xù)8s至2min。以后每天能觀察到1~2次的肢體和面部肌肉抽搐,點(diǎn)頭,雙下肢的站立或跌倒等發(fā)作類型。停止給藥后1周,再用KA0.4μg/μl測試(測試了16只),有75.0%(12/16)獲Ⅳ級(jí)或Ⅴ級(jí)癇性行為。當(dāng)KA連續(xù)注射3d時(shí)已有50%(12/24)大鼠獲Ⅳ級(jí)或Ⅴ級(jí)癇性發(fā)作。連續(xù)注射5d時(shí),已有62.5%(15/24)大鼠獲Ⅳ級(jí)或Ⅴ級(jí)癇性發(fā)作?？傸c(diǎn)燃率為75.0%(18/24)。整個(gè)點(diǎn)燃過程中,大鼠死亡數(shù)為12.5%(3/24),均因癲癇持續(xù)狀態(tài)而死亡。停止注射KA后1周癲癇發(fā)作基本消失,大鼠精神萎靡、進(jìn)食活動(dòng)少,消瘦,無癲癇的自發(fā)發(fā)作表現(xiàn)。但在3~4周后,大鼠又逐漸出現(xiàn)癲癇的反復(fù)自發(fā)發(fā)作,如面部肌肉,頭頸部抽搐,單側(cè)前肢陣攣,很快進(jìn)展至全身強(qiáng)直-陣攣發(fā)作,一般持續(xù)時(shí)間小于1min,發(fā)作均可自行終止。對(duì)照組大鼠無癇性發(fā)作。KA充分點(diǎn)燃的大鼠,有反復(fù)自發(fā)性的抽搐,其抽搐程度分級(jí)明晰,全身強(qiáng)直-陣攣發(fā)作十分顯著,癇性行為與EEG異常放電同步。Ⅰ級(jí)以上癇性行為皆伴EEG棘波,尖波或棘慢綜合波放電。為檢驗(yàn)點(diǎn)燃的持久性,在停止給藥后4周,再用KA測試,所有點(diǎn)燃大鼠仍保持其癲癇點(diǎn)燃狀態(tài),而且為高分級(jí)(Ⅳ級(jí)或Ⅴ級(jí))。2.2racine分類實(shí)驗(yàn)組大鼠中Ⅴ級(jí)8只,Ⅳ級(jí)12只,Ⅲ級(jí)2只,Ⅱ級(jí)2只;對(duì)照組大鼠均為0級(jí)。2.3動(dòng)物腦電活動(dòng)的變化2.3.1節(jié)奏低幅腦電波對(duì)照組大鼠額葉皮質(zhì)、海馬、杏仁核腦電圖顯示頻率為6~10Hz的以α節(jié)律為主的低幅(小于200μV)腦電波,額葉皮質(zhì)波幅>海馬波幅>杏仁核的波幅,沒有描記出癲癇波。2.3.2注藥側(cè)海馬的膠波特征注射KA3~5min后,動(dòng)物出現(xiàn)凝視時(shí),注藥側(cè)海馬額葉皮質(zhì)杏仁核描記出單個(gè)的小尖波,對(duì)側(cè)海馬額葉皮質(zhì)杏仁核葉也描記出單個(gè)的小尖波,波幅比注藥側(cè)低。10min后,注藥側(cè)的海馬額葉皮質(zhì)杏仁核描記出單個(gè)散在單個(gè)棘波。30min后,注藥側(cè)的散在棘波增多,波幅增高,伴有陣發(fā)性及叢集性棘波、慢波、棘-慢綜合波,海馬的棘波先于額葉皮質(zhì)和杏仁核,波幅高于后二者;對(duì)側(cè)海馬額葉皮質(zhì)杏仁核也有棘波慢波棘-慢綜合波等,但波幅較注藥側(cè)低。注射紅藻氨酸1~3h內(nèi)在雙側(cè)海馬、杏仁核、額葉皮質(zhì)均能描記出高幅的棘波棘-慢綜合波等,當(dāng)有癲癇發(fā)作時(shí)呈持續(xù)性叢集性棘波,注藥側(cè)波幅高于對(duì)側(cè)。6h后雙側(cè)海馬額葉皮質(zhì)杏仁核的棘波較前減少,當(dāng)有癲癇發(fā)作時(shí)又會(huì)出現(xiàn)陣發(fā)性的高幅棘波。1d后注藥側(cè)海馬額葉皮質(zhì)杏仁核描記出逐漸減少的棘波和短陣的棘-慢綜合波,對(duì)側(cè)描記出散在的尖波和棘波。1周后上述癇樣波明顯減少,2周后基本消失,只在注藥側(cè)海馬還能描記到散在的棘波;3~4周后上述部位的棘波又開始增多,癇樣發(fā)作時(shí)出現(xiàn)叢集性棘波或棘-慢綜合波,但同步性越來越差。2.4并發(fā)癥的比較實(shí)驗(yàn)組大鼠KA注射1周后,注藥側(cè)海馬CA3區(qū)內(nèi)錐體細(xì)胞變性腫脹;2周后錐體細(xì)胞崩解壞死;4周后錐體細(xì)胞幾乎消失,同時(shí)出現(xiàn)局部膠質(zhì)細(xì)胞增生,8周后對(duì)側(cè)海馬也出現(xiàn)上述病理變化,但是錐體細(xì)胞變性壞死較注藥側(cè)輕。對(duì)照組大鼠無上述改變。見圖1。2.5brdu免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組大鼠KA注射3周后,注藥側(cè)海馬齒狀回(DG)區(qū)內(nèi)可見BrdU陽性細(xì)胞較對(duì)照組明顯增多(P<0.01);對(duì)側(cè)海馬DG區(qū)也出現(xiàn)BrdU陽性細(xì)胞,較注藥側(cè)要少,但比對(duì)照組增多。BrdU免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞為胞核著色,基本呈圓形或卵圓形,以單個(gè)細(xì)胞多見,主要位于海馬齒回顆粒下區(qū)與齒回門區(qū)的邊界,門區(qū)亦有少量分布。對(duì)照組大鼠海馬DG區(qū)僅極少量散在分布。見圖2。3模型的活性及問題建立癲癇動(dòng)物模型是研究人類癲癇發(fā)病機(jī)制和提高治療效果的關(guān)鍵。大鼠是建立模型較為常用的動(dòng)物。目前,點(diǎn)燃方法已成為制作慢性癲癇模型最常用的方法之一。點(diǎn)燃發(fā)作行為學(xué)表現(xiàn)、病理變化及EEG特征與人類復(fù)雜部分性發(fā)作相似,模型穩(wěn)定持久,且不造成病理損傷灶等優(yōu)點(diǎn),是目前國際公認(rèn)研究人類慢性癲癇的理想模型。KA結(jié)構(gòu)類似谷氨酸,進(jìn)入腦內(nèi)后與海馬齒狀回顆粒細(xì)胞末梢上的KA受體結(jié)合,增加突觸末梢膜的通透性,使得顆粒細(xì)胞中的谷氨酸大量釋放而重吸收減少,從而引起突觸后神經(jīng)元海馬CA3區(qū)錐體細(xì)胞過度興奮,產(chǎn)生興奮性突觸后電流,最后導(dǎo)致CA3區(qū)的錐體細(xì)胞減少、消失,從而誘發(fā)TLE。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,大鼠TLE的癇性發(fā)作和腦電圖(EEG)呈現(xiàn)典型的3期不同的行為學(xué)表現(xiàn):急性期(注射KA后1周內(nèi))、靜止期(注射KA后1周至1個(gè)月)、慢性期(注射KA1個(gè)月后)3個(gè)階段變化,其癇性發(fā)作形式與人類TLE發(fā)作時(shí)的過程相似;癲癇發(fā)作與癇樣波基本同步,起始于海馬并向額葉皮質(zhì)杏仁核等傳導(dǎo)的癇樣波是TLE模型的神經(jīng)電生理基礎(chǔ);病理變化提示長期癲癇發(fā)作會(huì)導(dǎo)致海馬錐體細(xì)胞逐漸變性、壞死、缺失,類似于人類TLE的海馬硬化。所以,用立體定向方法建立的TLE模型類似于人類的TLE,是研究人類TLE發(fā)病機(jī)制、電生理特征等的理想模型。為檢驗(yàn)這種動(dòng)物模型的持久性,在點(diǎn)燃成功停止給藥后4周,再用相同劑量的KA測試,所有點(diǎn)燃大鼠仍保持其癲癇點(diǎn)燃狀態(tài),而且為高分級(jí)(Ⅳ級(jí)或Ⅴ級(jí))。說明該模型一旦被點(diǎn)燃,具有永久性特征。本研究建模成功率高,證明本實(shí)驗(yàn)方法可靠;具有如下的特點(diǎn):①本模型在發(fā)作潛時(shí)、癇性發(fā)作的行為反應(yīng)、病理變化、腦電表現(xiàn)、致癇效應(yīng)的穩(wěn)定性和永久性等與KA經(jīng)腹腔或皮下給藥途徑建立的模型相似,但建模周期較常規(guī)模型明顯縮短;②本模型大鼠TLE的發(fā)作和腦電圖表現(xiàn)可以從急性期、靜止期、慢性期3個(gè)時(shí)期進(jìn)行區(qū)別;③本方法所需KA量較小;④定位準(zhǔn)確:通過深部電極,可直接得到相關(guān)部位的腦電信息,便于排除外界因素對(duì)腦電的干擾,利用計(jì)算機(jī)軟件將腦電信號(hào)與視頻圖像相結(jié)合,得到類似于臨床視頻腦電監(jiān)測的效果;⑤本模型癇樣波的起源、同步和非同步較典型、明確,與人類TLE發(fā)作時(shí)腦電圖的變化相似。大鼠KA快速點(diǎn)燃模型的成功建立對(duì)進(jìn)一步觀察TLE的發(fā)病機(jī)制和篩選抗癲癇藥物提供了理想的動(dòng)物模型。在人類,至今仍一致公認(rèn)顳葉是癲癇的好發(fā)部位,且極易成為藥物難治性癲癇。但只要病例選擇適當(dāng),致癇灶定位精確,手術(shù)切除的療效是肯定的,且復(fù)發(fā)率低,并發(fā)癥也少。由于癲癇是各種原因所致的異常神經(jīng)元放電的臨床綜合征,腦電圖尤其是視頻腦電圖在癲癇診斷和術(shù)前致癇灶的發(fā)現(xiàn)和定位上起著至關(guān)重要的作用。因此采用深部電極通過對(duì)TLE動(dòng)物模型的腦電活動(dòng)進(jìn)行描記分析有助于提高對(duì)TLE發(fā)作過程中神經(jīng)電生理活動(dòng)的認(rèn)識(shí)。在本癲癇模型中,癲癇誘導(dǎo)的海馬錐體細(xì)胞損傷與癲癇患者所觀察到的細(xì)胞損傷相似,而這種病理改變構(gòu)成了癲癇慢性自發(fā)性發(fā)作的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。近年來,BrdU一直被作為細(xì)胞分裂的標(biāo)記用于研究神經(jīng)發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,實(shí)驗(yàn)組大鼠在KA注射3周后,注藥側(cè)海馬DG區(qū)內(nèi)可見BrdU陽性細(xì)胞較對(duì)照組明顯增多(P<0.01),對(duì)側(cè)海馬DG區(qū)也出現(xiàn)BrdU陽性細(xì)胞,較注藥側(cè)要少,但比對(duì)照組增多,提示在癲癇的發(fā)生、發(fā)展過程中,伴隨著細(xì)胞增殖現(xiàn)象。即有神經(jīng)發(fā)生增加