腺病毒提取與純化物品準(zhǔn)備：離心管：BackmanCat：#331372（36000rpm離心用13.2ml）；BackmanCat：#342412（65000rpm離心用5.1ml）；消毒，多備用一套；離心管帽：離心管BackmanCat：#331372蓋，消毒；離心管BackmanCat：#342412外蓋；離心管BackmanCat：#342412中蓋，BackmanCat：#342883；熱封蓋：離心管BackmanCat：#342412熱封蓋，消毒；其他物品：MiniQ：2L，消毒；大燒杯（1L）：2個(gè)，消毒；中號(hào)鑷子，小號(hào)鑷子：1把中號(hào)和3把小號(hào)，消毒；無(wú)菌注射器：1ml、5ml、10ml，若干；移液槍?zhuān)?把；移液管：2ml、10ml，若干；廢液缸：1個(gè)；無(wú)菌手套：若干；酒精、棉球；Marker筆；配液：CsCl：1.25g/ml：9.04gCsCl+25mlPBS；1.35g/ml：12.8gCsCl+25mlPBS；1.40g/ml：15.5gCsCl+25mlPBS；配好后過(guò)濾。Viruslysisbuffer(pH7.4，50ml)：0.1%SDS0.05g10mMTrisbase0.0606g1mMEDTA0.0186gDialysisbuffer（pH7.6，1.5L）：10mMTrisbase1.82g135mMNaCl11.83g1mMMgCl250%Glycerol750ml三、裂解擴(kuò)增了腺病毒的293細(xì)胞：1、從-80℃冰箱中取出以前擴(kuò)增好的感染病毒的293細(xì)胞沉淀，解凍后用4mlPBS重懸，并轉(zhuǎn)移到置于冰上的50ml離心管中；2、用繩子拴好50ml離心管，置于液氮中30分鐘；3、取出后置于37℃水浴，搖至溶解，最大速度vortex一分鐘，離心，5000rpm，10分鐘；4、轉(zhuǎn)移上清到一個(gè)15ml的離心管中；5、向下層沉淀中加入3ml的PBS，vortex混勻，再放于液氮中，再反復(fù)凍融兩次，收集到的裂解液不超過(guò)9ml為宜；6、把收集到的上清再離心5000rpm，10分鐘（上清可暫時(shí)不取出，節(jié)省步驟），放于冰上。四、正式實(shí)驗(yàn)：預(yù)冷轉(zhuǎn)頭至4℃（BackmanSW41Ti及其離心管套，BackmanVTi90），熱封儀充電。1、UV消毒超凈臺(tái)，檢查離心機(jī)配件：轉(zhuǎn)頭SW41Ti及離心管套、離心管（Cat：#331372）、離心管蓋、離心管蓋固定器、離心管架；2、取出消毒好的離心管放在專(zhuān)用的離心管架上，用移液槍分別加2ml1.25g/mlCsCl，再在液體的底部緩慢加入1ml1.40g/mlCsCl；注：加入時(shí)將移液管伸入到離心管底部，將移液槍調(diào)到最低檔緩慢加入，拔出移液槍時(shí)也要慢，加好后可以看到不同濃度的CsCl之間有明顯的分層。用移液槍將293裂解液緩慢加滿(mǎn)，配平，按1-4，2-5，3-6的順序；注：管子要注意做好標(biāo)記。5、用酒精擦離心管套，把裝好樣本的離心管輕輕放入，放上消毒好的蓋子，用離心管蓋固定器擰緊；注：離心時(shí)6個(gè)離心管套都要掛上，空的離心管套也需蓋上蓋子并擰緊，并掛在相應(yīng)的掛鉤上，注意平衡。6、離心36000rpm，65min，4℃；設(shè)置參數(shù)：36000rpm―enter―65min―enter―4℃―enter―enter+star；當(dāng)真空<750時(shí)，開(kāi)始加速，約3min可達(dá)36000rpm。7、離心時(shí)，檢查下一步離心所需配件：轉(zhuǎn)頭BackmanVTi90、離心管（Cat：#342412）、離心管架、離心管外蓋、離心管中蓋（Cat：#342883）、專(zhuān)用螺絲、專(zhuān)用扳手、專(zhuān)用離心管加夾；8、離心完成后，小心取下離心管套，擰開(kāi)蓋子，用鑷子取出離心管，找到要抽取的完整病毒帶；9、穿刺病毒帶：用5ml注射器從病毒帶下方約1ml處緩慢向斜上放刺入，抽取病毒帶，抽完后用手堵住離心管上口，再將枕頭抽出；注：穿刺處先用酒精消毒，刺入時(shí)旋轉(zhuǎn)，不要太用力，針頭平面向上，注意不要回打，抽到病毒約1ml。FromAdEasyVectorSystem，Qbiogene,Inc.10、將抽出來(lái)的病毒轉(zhuǎn)移到5.1ml離心管（Cat：#342412）中，用1.35g/mlCsCl填滿(mǎn)；注：加CsCl時(shí)要輕輕彈一彈管壁以清除氣泡，加CsCl時(shí)針頭應(yīng)在液面以下，以減少氣泡的產(chǎn)生，若殘留氣泡容易導(dǎo)致離心時(shí)不平衡，離心管變形。11、熱封：用消毒好的熱封蓋蓋好離心管口，用熱封儀（cat＃358314）加熱，垂直輕輕下壓到離心管頸部與管身交界處（約30sec），用冷卻管套住熱封管蓋冷卻；12、將熱封好的離心管放入到轉(zhuǎn)頭BackmanVTi90的對(duì)稱(chēng)位置，依次加入內(nèi)蓋、外蓋，先用專(zhuān)用螺絲擰，再用專(zhuān)用扳手?jǐn)Q緊（用力到扳手指針達(dá)120即可）；13、離心：轉(zhuǎn)頭BackmanVTi90，72300rpm，3h，4℃；

14、離心時(shí)，用75％酒精消毒透析袋（剪成約5cm一個(gè)，不要太短）、夾子（要配套，一個(gè)帶磁鐵和一個(gè)不帶磁鐵），30min以上；15、離心完后，用專(zhuān)用的離心管夾取出離心管后置于架子上；16、第二次穿刺：用10ml注射器針頭導(dǎo)氣，用1ml針管配5ml的針頭穿刺病毒帶（從病毒帶下方約0.5cm處斜向上刺入），方法同前；17、病毒帶抽完后，抽出注射器，用針頭套套住針頭，標(biāo)記好至于冰上；18、透析：取出浸泡于酒精中的透析袋，用牙簽撐開(kāi)透析袋，用消毒的milli-Q水沖凈其上的酒精，再末端折疊一下，用夾子夾好。將注射器中的液體注射入袋中，折疊上端，用夾子夾住，放于透析液中，隔1小時(shí)換液一次，反復(fù)3次。最后一次的透析緩沖液保存至下次使用；注：小心針頭不要刺穿透析袋，夾子要做好標(biāo)記。19、收集病毒：取出透析袋，用消毒milli-Q沖洗透析袋，用酒精棉球擦夾子內(nèi)緣，在夾子內(nèi)緣剪開(kāi)透析袋，用200ul槍吸出液體轉(zhuǎn)移到標(biāo)記好的1.5mlEP管中-20℃保存；20、測(cè)濃度：1）、要用復(fù)溫好的Viruslysisbuffe裂解腺病毒：取6ul病毒加入54ulViruslysisbuffe，第三次透析液為空白對(duì)照，