核酸分子雜交技術嚴永敏細胞與分子診斷系1目錄根本原理核酸探針核酸分子雜交技術2變性在熱、酸堿或變性劑作用下，DNA雙螺旋的氫鍵斷裂，解離為兩條單鏈DNA的現象稱為變性。變性的特征生物學活性喪失,增色效應核酸的變性與復性3磷酸二酯鍵

DNA和RNA的一級結構4DNA解鏈曲線增色效應(hyperchromiceffect)

核酸分子加熱變性時，其在260nm處的紫外吸收急劇增加的現象。Tm值：當紫外吸收變化到達最大變化的半數值時，此時所對應的溫度稱為熔解溫度〔Tm〕、變性溫度或中點解鏈溫度。5分子雜交當兩條不同來源的單鏈核酸分子DNA-RNA或DNA-DNA鏈之間存在互補的堿基序列時，通過堿基互補配對形成雙鏈雜交體的過程，稱為分子雜交〔molecularhybridization〕。分子雜交圖89概念：用同位素或其他化學方法標記的與待測靶核苷酸序列互補雜交的核酸片段〔DNA或RNA〕。用途：檢測待檢核酸樣品中的特定基因序列。(DNA-DNA;DNA-RNA;RNA-RNA)要求：特異性，來源方便第二節(jié)核酸探針10

hybridizationDNA:DNA5’ATGCCGAT3’TACGGCDNA:RNA5’ATGCGTA3’UACGCAURNA:RNA5’AUGCUACG3’UACGAUGC111)基因組DNA探針；2)cDNA探針；3)RNA探針；核酸探針的類型：4)寡核苷酸探針。12〔一〕基因組DNA探針1.來源：這類探針來源于某種生物的基因組多為某一基因的全部或局部序列。2.制備方法:〔1〕基因克隆的方法〔2〕聚合酶鏈反響(PCR)

133.特點:〔1〕多克隆在載體中的DNA片段，可以無限繁殖，取之不盡?！?〕相對RNA而言，DNA探針不易降解，標記方法也較成熟。14〔二〕cDNA探針1.制備:cDNA文庫中篩選。2.特點:不存在內含子和高度重復序列，是一種較理想的核酸探針，尤其是用于基因表達的研究。15〔三〕RNA探針特點：1〕單鏈探針，效率高，靈敏度高；2〕RNA/RNA、RNA/DNA更穩(wěn)定，特異性高；3〕不穩(wěn)定，易降解。16〔四〕寡核苷酸探針特點:◆根據需要來合成相應的核酸序列，防止天然探針的缺點；◆大多數長度一般為20～50bp；◆由于探針的長度較短，特異性較低，雜交信號較弱17常用的探針標記物：

放射性同位素：

3H、32P、35S、125I等。核酸探針的標記特點:◆靈敏度高，特異性高；◆檢出限：1~10ug；◆環(huán)境污染，半衰期短。18常用放射性核素的物理性質αβγ非放射性19FITC異硫氰酸酯TRITC硫氰酸四甲基羅達明人染色體不同熒光素染色結果

非放射性同位素：熒光染料、地高辛素、辣根過氧化酶、堿性磷酸酶等。20缺口平移標記法示意圖酶促法1.缺口平移法〔nicktranslation〕探針標記方法:212．隨機引物法(randompriming)人工合成6~8bp各種不同排列順序混合物引物在DNA聚合酶作用下，合成與探針DNA互補的DNA鏈，當在反響液中參加一種被標記dNTP時，即可形成標記的DNA探針，但探針DNA序列是長短不等的。優(yōu)點：比活度高，結果穩(wěn)定22隨機引物標記法示意圖233．DNA探針的末端標記

〔1〕Klenow大片段的末端標記法323個氨基酸小片段5核酸外切酶活性大片段

/

Klenow片段

604個氨基酸DNA聚合酶活性

5核酸外切酶活性N端C端木瓜蛋白酶24利用KlenowDNA聚合酶標記3’-端DNA探針

25〔2〕多核苷酸激酶標記法〔polynucleofidekinase，PNK)多核苷酸激酶標記法示意圖*不能進行非放射性標記26DNA半抗原標記探針的檢測顯色系統(tǒng)：堿性磷酸酶——————NBT辣根過氧化物酶————DAB底物非放射性探針的檢測四唑硝基藍二氨基聯苯胺27制備特異性探針所需要的根本條件1.被檢基因結構清楚；2.有明確的基因產物;3.某一基因產物；

具備以上條件之一就可以制備特異性基因探針。28第三節(jié)核酸分子雜交技術雜交類型檢測目的及范圍Southern印跡雜交檢測經凝膠電泳分離且轉移至膜上的DNA分子Northern印跡雜交檢測經凝膠電泳分離且轉移至膜上的RNA分子菌落雜交檢測固定在膜上，經裂解從細菌體釋放的DNA分子斑點雜交檢測固定在膜上的DNA或RNA分子原位雜交檢測細胞或組織中的DNA或RNA分子29PaperTowels1tissueSDSProtKPhenolChloroETOHSpin一、Southern印跡雜交

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毛細管轉移示意圖電轉移示意圖31

Northern印跡雜交流程圖二、Northern印跡雜交32Southern雜交結果Northern雜交結果33基因表達產物的檢測

Western印跡法蛋白質水平上的雜交技術，又稱為免疫印跡，即檢測蛋白質與標記的特定蛋白抗體結合，經放射自顯影顯示條帶，根據條帶密度確定蛋白質表達量。優(yōu)點:分辨率高(1~5ng);特異;簡便;穩(wěn)定34準備PAGE膠樣品的制備加樣SDS(蛋白先定量)蛋白質的電轉移