PAGEIGBT7713國家標(biāo)準(zhǔn)學(xué)士學(xué)位論文PAGEIV腸炎沙門氏菌感染濟(jì)寧百日雞后不同時間的盲腸轉(zhuǎn)錄組變化

符號說明SE:Salmonellaenteritidis,腸炎沙門氏菌RNA-seq：RNASequencing，RNA測序DPI:day(s)postinfection,感染后天數(shù)DEG:DifferentlyExpressedGene,差異表達(dá)基因PBS：PhosphateBufferedSaline,磷酸鹽緩沖液GO：GeneOntology,基因本位論KEGG：Kyotoencyclopediaofgenesandgenomes,京都基因與基因組百科全書miRNA：microRNA,微小RNAPCR：polymerasechainreaction,聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)QRT-PCR：Quantitativereal-timePCR,實(shí)時熒光定量PCRTLRs:toll-likereceptor,Toll樣受體NGS：Nextgenerationsequence,第二代測序技術(shù)BP：biologicalprocess,生物過程MF：molecularfunction,分子功能CC：cellularcomponent,細(xì)胞組分WGCNA：WeightedGeneCo-ExpressionNetworkAnalysis,加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析TOM：topologicaloverlapmatrix,拓?fù)渲丿B矩陣ME：moduleeigengene,模塊特征基因GS：genesignificance,基因顯著性目錄前言 11.1沙門氏菌 11.1.1沙門氏菌病癥 21.1.2家禽感染沙門氏菌 21.1.3禽沙門氏菌病 31.1.4家禽菌感沙門氏菌機(jī)制研究進(jìn)展 51.2轉(zhuǎn)錄組學(xué) 61.2.1基本定義 61.2.2轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究方法歷程概述 71.2.3RNA-seq的數(shù)據(jù)分析 81.2.4轉(zhuǎn)錄組測序在家禽中的應(yīng)用 121.3抗病遺傳育種 131.3.1抗病遺傳育種的必要性 131.3.2抗病育種遺傳基礎(chǔ) 141.3.3抗病遺傳育種的途徑 151.4本研究的目的與意義 17材料與方法 172.1試驗(yàn)材料 172.1.1試驗(yàn)儀器與試劑 172.1.2試驗(yàn)試劑 182.1.3生物信息學(xué)主要數(shù)據(jù)庫及分析軟件 192.1.4常用試劑的配制 202.1.5試驗(yàn)動物及菌種 202.2試驗(yàn)方法 202.2.1腸炎沙門氏菌接種及樣品采集 202.2.2組織總RNA提取 212.2.3測序文庫制備 222.2.4原始測序數(shù)據(jù)處理 232.2.5基因的差異表達(dá)分析 232.2.6差異表達(dá)基因的GO和KEGG富集分析 242.2.7加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析 242.2.8差異表達(dá)基因的qRT-PCR驗(yàn)證 25結(jié)果與分析 273.1測序結(jié)果質(zhì)量評估 273.2序列比對 293.3差異表達(dá)基因的鑒定 293.4差異表達(dá)基因顯著功能富集 13.4.1KEGGpathway富集分析 13.4.2GO富集分析 33.5加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析 93.5.1確立軟閾值 103.5.2識別表達(dá)模塊與關(guān)聯(lián)性狀 13.5.3模塊的功能分析 33.5.4篩選關(guān)鍵基因 43.6時間序列分析 53.6.1區(qū)分基因表達(dá)趨勢。 53.6.2時間序列基因的GO富集分析 63.7測序結(jié)果驗(yàn)證 7討論 8結(jié)論 12致謝 13

中文摘要腸炎沙門氏菌（Salmonellaenteritidis，SE）是一種常見的人畜共患病原菌，不僅能夠引起畜禽的腸胃炎疾病或致死，也對人類的健康造成嚴(yán)重威脅，給養(yǎng)禽業(yè)和社會造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失和危害。生物組織在受到外界刺激或壓力下,RNA會在全轉(zhuǎn)錄組層面上發(fā)生廣泛改變,影響基因表達(dá)的調(diào)控,這種轉(zhuǎn)錄調(diào)控是生物應(yīng)激反應(yīng)的重要機(jī)制。隨著第二代測序技術(shù)的迅猛發(fā)展，其高通量、快速、低成本的特點(diǎn)使研究更容易從轉(zhuǎn)錄調(diào)控角度解決生物學(xué)問題。本研究擬通過高通量測序技術(shù)分析腸炎沙門氏菌感染濟(jì)寧百日雞后不同時間的濟(jì)寧百日雞雛雞盲腸組織的轉(zhuǎn)錄調(diào)控轉(zhuǎn)錄組的動態(tài)變化。本研究分別對健康的和感染腸炎沙門氏菌后1、3、4、14天雛雞的盲腸進(jìn)行測序和生物信息學(xué)分析。結(jié)果顯示：（1）對測序產(chǎn)出的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾，最終在24個樣品中共獲得189.7Gb的數(shù)據(jù)，平均每個樣品的數(shù)據(jù)量為7.9Gb。對腸炎沙門氏菌試驗(yàn)組與對照組進(jìn)行基因差異表達(dá)分析，,在感染后第1天（1dpi）時篩選到共有530個基因表達(dá)顯著差異表達(dá)的基因(P<0.05、|log2foldchange|>1)，其中上調(diào)的差異表達(dá)基因258個，下調(diào)的差異表達(dá)基因242個；在3dpi時顯著差異表達(dá)基因數(shù)目最多，共發(fā)現(xiàn)4個時間點(diǎn)中數(shù)量最多的顯著差異表達(dá)的基因共1441個，其中上調(diào)的差異表達(dá)基因782個，下調(diào)的差異表達(dá)基因695個其他地方按照這個句式進(jìn)行修改。；在7dpi中共發(fā)現(xiàn)476個顯著差異表達(dá)的基因，其中試驗(yàn)組上調(diào)基因264個，下調(diào)的基因212個；在14dpi中共發(fā)現(xiàn)432個顯著差異表達(dá)的基因，其中上調(diào)的差異表達(dá)基因283個，下調(diào)的差異表達(dá)基因149個，其差異表達(dá)基因的數(shù)量是4個時間點(diǎn)中最少的。其他地方按照這個句式進(jìn)行修改。（2）差異表達(dá)基因信號通路富集結(jié)果顯示，1dpi差異表達(dá)基因顯著富集在神經(jīng)活性配體-受體相互作用、吞噬體、PPAR信號通路等KEGGKEGG信號通路中。3dpi差異表達(dá)基因顯著富集在細(xì)胞因子-細(xì)胞因子-受體相互作用、Toll樣受體信號通路、視黃醇代謝等21個通路中。7dpi差異表達(dá)基因顯著富集在神經(jīng)活性配體-受體相互作用、細(xì)胞粘附分子（CAMs）、α-亞麻酸代謝等14個通路中。14dpi差異表達(dá)基因顯著富集在組氨酸代謝、MAPK信號通路等10個KEGG通路中。（3）對差異表達(dá)基因進(jìn)行基因本體論（GO）富集結(jié)果分析：顯示，1dpi上調(diào)差異基因顯著富集到陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)、有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)、離子轉(zhuǎn)運(yùn)、轉(zhuǎn)運(yùn)體活性離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)活性、羧酸跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)活性等term找個相應(yīng)的中文。；下調(diào)差異基因顯著富集到多細(xì)胞組織過程、離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞投射、肌節(jié)等，還有7個離子通道相關(guān)term如離子通道活性、離子通道活性、門通道活性。3dpi上調(diào)差異基因顯著富集到大量免疫有關(guān)的term。如：免疫系統(tǒng)過程、免疫反應(yīng)、防御反應(yīng)、白細(xì)胞活化、白細(xì)胞介素-8受體結(jié)合等。3dpi下調(diào)的差異基因在生物過程中顯著富集于離子運(yùn)輸和代謝兩類term。7dpi上調(diào)差異基因主要富集于免疫、細(xì)胞膜、連接相關(guān)term。下調(diào)差異基因主要富集于細(xì)胞外膜、血紅素結(jié)合、氧結(jié)合等term。14dpi上調(diào)差異基因主要富集于信號傳導(dǎo)相關(guān)term，而下調(diào)基因主要富集于代謝有關(guān)的term。找個相應(yīng)的中文。（4）利用WGCNA的分析方法,對感染后4個時間點(diǎn)的盲腸轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析，結(jié)果共發(fā)現(xiàn)；找到了4個相關(guān)性較高的模塊。1、3、7、14dpi分別對應(yīng)能量、非編碼過程、免疫、發(fā)育相關(guān)功能的模塊。分別篩選出5、8、6、5個樞紐基因。模塊lightyellow的樞紐基因?yàn)镸AP3K14、COX5A、UQCRQ、ELL、HSPB11為樞紐基因；模塊pink的樞紐基因?yàn)镵LHL12、NIP7、NOB1、ADAM9、AAAS、SCARB2、SARS、CHEK1；模塊green的樞紐基因?yàn)镚MFB、SLC2A14、TLR7、LCP1、SMAP2、TRAF2；模塊green的樞紐基因?yàn)镸XRA8、CXCL14、C39A13、PODN、ADAMTS10。（5）選擇β-actin作為內(nèi)參基因，選取差異表達(dá)基因TLR7、CCL1、CXCL13、NCF1C、FKBP5、SOUL等，對6個基因的進(jìn)行熒光定量PCR結(jié)果檢測，其上下調(diào)結(jié)果與測序結(jié)果一致，證明測序結(jié)果可靠。綜上所述，本研究結(jié)果證明腸炎沙門氏菌感染后的雛雞盲腸轉(zhuǎn)錄組在1、3、7、14dpi發(fā)生變化，機(jī)體對腸炎沙門氏菌感染的應(yīng)對機(jī)制在不同時間存在差異。腸炎沙門氏菌感染可能存在一定潛伏期，其免疫反應(yīng)在感染后3天左右較為強(qiáng)烈，之后濟(jì)寧百日雞代謝能力降低，免疫反應(yīng)減弱。結(jié)論要具體些，如何變化，哪些信號通路，GO，基因發(fā)揮主要作用？關(guān)鍵詞：濟(jì)寧百日雞；腸炎沙門氏菌；轉(zhuǎn)錄組測序；盲腸；WGCNAGBT7713國家標(biāo)準(zhǔn)學(xué)士學(xué)位論文AbstractSalmonellaenteritidis(SE)isacommonzoonoticpathogenthatcannotonlycausegastroenteritisordeathoflivestockandpoultry,butalsoposeaseriousthreattohumanhealth,causingsevereeconomiclossestothepoultryindustryandsociety.Andharm.Withtherapiddevelopmentofthesecond-generationsequencingtechnology,itshigh-throughput,fast,andlow-costcharacteristicsmakeiteasierforresearcherstosolvebiologicalproblemsfromtheperspectiveoftranscriptionregulation.ThisstudyintendstoanalyzethedynamicchangesofthececumtranscriptomeofJininghundred-day-oldchickensatdifferenttimesbySalmonellaenteritidisinfectionbyhigh-throughputsequencingtechnology.Theresultsshowthat:(1)Afterfilteringtherawdataoutputfromsequencing,atotalof189.7Gbofdatawasobtainedin24samples,withanaveragedatavolumeof7.9Gbpersample.ThedifferentialexpressionanalysisofSalmonellaenteritidistestgroupandcontrolgroupwasperformed,and530significantlydifferentiallyexpressedgeneswerescreenedat1dayafterinfection(P<0.05,|log2foldchange|>1),ofwhich258differentiallyexpressedgeneswereup-regulated.,Down-regulated242differentiallyexpressedgenes;at3dpi,atotalof1,441mostsignificantlydifferentially-expressedgeneswerefoundat4timepoints,ofwhich782weredifferentiallyup-regulatedgenesand695differentially-down-regulatedgenes;at7dpiTheChineseCommunistPartyfound476significantlydifferentlyexpressedgenes,ofwhich264geneswereup-regulatedand212genesweredown-regulatedinthetestgroup;432significantlydifferently-expressedgeneswerefoundin14dpi,ofwhich283wereup-regulateddifferentially-expressedgenesanddown-regulateddifferentially-expressedgenes.149,thenumberofdifferentiallyexpressedgeneswasthesmallestamong4timepoints.(2)1dpidifferentiallyexpressedgenesweresignificantlyenrichedinKEGGpathwayssuchasneuroactiveligand-receptorinteractions,phagosomes,andPPARsignalingpathways.The3dpidifferentiallyexpressedgenesweresignificantlyenrichedin21pathwaysincludingcytokine-cytokine-receptorinteraction,Toll-likereceptorsignalingpathway,andretinolmetabolism.The7dpidifferentiallyexpressedgenesweresignificantlyenrichedin14pathwaysincludingneuroactiveligand-receptorinteractions,celladhesionmolecules(CAMs),andalpha-linolenicacidmetabolism.14dpidifferentiallyexpressedgenesweresignificantlyenrichedin10KEGGpathwayssuchashistidinemetabolismandMAPKsignalingpathway.(3)GOenrichmentanalysisofdifferentiallyexpressedgenes:1dpiup-regulatesdifferentialgenessignificantlyenrichedtotermssuchasaniontransport,organicaniontransport,iontransport,transporteractiveiontransmembranetransportactivity,carboxylicacidtransmembranetransportactivity,etc.terms;Thedifferentialgenesweresignificantlyenrichedinmulticellulartissueprocesses,iontransmembranetransport,cellprojection,sarcomere,etc.,andtherewere7ionchannelrelatedtermssuchasionchannelactivity,ionchannelactivity,andgatechannelactivity.The3dpiup-regulateddifferentialgenesweresignificantlyenrichedtoalargenumberofimmune-relatedterms.Suchas:immunesystemprocess,immuneresponse,defenseresponse,leukocyteactivation,interleukin-8receptorbinding,etc.Differentialgenesdown-regulatedat3dpiaresignificantlyenrichedintermsofiontransportandmetabolisminbiologicalprocesses.The7dpiup-regulateddifferentialgenesaremainlyconcentratedinimmune,cellmembrane,andconnection-relatedterms.Thedown-regulateddifferentialgenesaremainlyconcentratedintheoutercellmembrane,hemebinding,oxygenbindingandotherterms.The14dpiup-regulateddifferentialgenesweremainlyconcentratedinthesignaling-relatedterms,whilethedown-regulatedgenesweremainlyconcentratedinthemetabolic-relatedterms.(4)UsingtheWGCNAanalysismethod,aweightedgeneco-expressionnetworkanalysiswasperformedonthececumtranscriptomeatfourtimepointsafterinfection;fourmoduleswithhighcorrelationwerefound.1,3,7,and14dpicorrespondtomodulesforenergy,non-codingprocesses,immunity,anddevelopment-relatedfunctions,respectively.Five,eight,six,andfivepivotgeneswerescreened,respectively.ThepivotgenesofmodulelightyellowareMAP3K14,COX5A,UQCRQ,ELL,andHSPB11asthepivotgenes;thepivotgenesofmodulepinkareKLHL12,NIP7,NOB1,ADAM9,AAAS,SCARB2,SARS,CHEK1;thepivotgenesofmodulegreenareGMFB,SLC2A14,TLR7,LCP1,SMAP2,TRAF2;thepivotgenesofmodulegreenareMXRA8,CXCL14,C39A13,PODN,andADAMTS10.(5)Selectβ-actinastheinternalreferencegene,selectdifferentiallyexpressedgenesTLR7,CCL1,CXCL13,NCF1C,FKBP5,andSOUL,andperformquantitativequantitativePCRdetectionon6genes.Theup-downresultsareconsistentwiththesequencingresults,whichprovesthatthesequencingresultsarereliable.Insummary,theresultsofthisstudydemonstratethatthececaltranscriptomeofchickensinfectedwithSalmonellaenteritidischangesat1,3,7,and14dpi,andthatthebody'sresponsemechanismtoSalmonellaenteritidisinfectionvariesatdifferenttimes.TheremaybeacertainincubationperiodforSalmonellaenteritidisinfection,anditsimmuneresponseisstrongabout3daysafterinfection,afterwhichthemetaboliccapacityandimmuneresponseoftheJining100-daychickenarereduced.KeyWords:JiningBairichicken;Salmonellaenteritis;RNA-seq;cecum;WGCNGBT7713國家標(biāo)準(zhǔn)學(xué)士學(xué)位論文PAGE26前言1.1沙門氏菌沙門氏菌（Salmonella）對人類的威脅已有數(shù)百年之久，全球每年約有1億多人感染，是具有重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義的人畜共患病原之一ADDINNE.Ref.{FAD512EA-E9ED-4FEF-A279-9FCE6411BCBD}(Ze?del,1969)(Ze?del,1969)。在亞太地區(qū)，平均10萬人中會有32人不同程度的被沙門氏菌所感染，其中東亞地區(qū)感染的情況最為嚴(yán)重，每10萬人中有3600人被感染，因感染沙門氏菌造成死亡人數(shù)在世界范圍內(nèi)達(dá)到15.5萬人ADDINNE.Ref.{E3C2654C-4396-475C-9425-C9F7D2619C33}(Parryetal.,2004)。據(jù)報道，2015年腸炎沙門氏菌是美國最常見的食源性沙門氏菌病，2015年每十萬人中有2.81人感染并發(fā)病ADDINNE.Ref.{D1B66AC6-5F51-4DA8-8B04-0C66F7AF0B7F}(Hogueetal.,1997)。在中國細(xì)菌性食物中毒70%～80%是由沙門氏菌引起的，而引起沙門氏菌病的食物90%以上由畜禽產(chǎn)品構(gòu)成。據(jù)統(tǒng)計(jì)，中國每年至少有200萬人不同程度的感染沙門氏菌，成千上萬的嚴(yán)重感染者將住院治療ADDINNE.Ref.{6C8D1774-57CC-4D5F-8FA8-535E39C8ABCC}(Zhaetal.,2013)。沙門氏菌屬寄生于人類和動物腸道內(nèi)，是生化反應(yīng)和抗原構(gòu)造相似的革蘭氏陰性桿菌。大?。?.6～1.0）×2～3um，無芽胞，一般有鞭毛，無莢膜，兼性厭氧菌，在普通瓊脂平板上形成中等大小、半透明的圓型菌落ADDINNE.Ref.{5480A842-7F3A-4D1F-9920-3EE629E29005}(Jameson,1966)。在腸道桿菌選擇性培養(yǎng)基上形成無色菌落。不發(fā)酵乳糖和蔗糖不產(chǎn)生吲哚，不分解尿素，VP試驗(yàn)陰性，大多產(chǎn)生硫化氫。能夠發(fā)酵甘露醇、麥芽糖、和葡萄糖，只有傷寒沙門氏菌產(chǎn)酸不產(chǎn)氣外，其他沙門氏菌均產(chǎn)酸產(chǎn)氣。沙門氏菌通過直接或間接接觸眾多的感染動物及其制品和排泄物而使人患病，受污染的牛羊禽肉、生牛奶、蛋和蛋制品以及不潔凈的水是沙門菌屬的常見傳染源ADDINNE.Ref.{7CBBEFAE-215A-4D12-B557-C75A063FD755}(Meloetal.,2016)。隨著食品工業(yè)產(chǎn)業(yè)化和全球化，沙門氏菌感染的流行模式也將產(chǎn)生新的變化，人們的飲食習(xí)慣的改變、人口流動、經(jīng)濟(jì)全球化、細(xì)菌抗病性也會對沙門氏菌的傳播產(chǎn)生很大影響。因此，只有及時了解和掌握沙門氏菌感染形式的動態(tài)變化，才能準(zhǔn)確應(yīng)對公共衛(wèi)生的需求，減少和控制沙門氏菌對人類食品健康以及畜牧產(chǎn)品安全的威脅。目前，全世界共發(fā)現(xiàn)沙門氏菌2500余種血清型ADDINNE.Ref.{87C14102-F509-4BCF-A2B2-E5B418EFA7C6}(Caldwelletal.,1995)。鼠傷寒沙門氏菌（Salmonellatyphimurium）、腸炎沙門氏菌（

Salmonellaenteritis）、海德爾堡沙門氏菌（Salmonellaheidelberg）、紐波特沙門氏菌（SalmonellaNewport）、豬霍亂沙門氏菌（SalmonellaCholeraesuis

）等遍布世界各地。1.1.1沙門氏菌病癥沙門氏菌通過毛細(xì)血管和淋巴管侵入腸粘膜上皮細(xì)胞從而進(jìn)入血液，從而導(dǎo)致菌血癥或全身感染，細(xì)菌被免疫細(xì)胞吞食時會產(chǎn)生內(nèi)毒素，這將引起腸炎腹瀉等反應(yīng)ADDINNE.Ref.{85568F78-A648-455C-BA1E-D7DA3447AC15}(Galán,1996)。其臨床表現(xiàn)按其主要癥候群分為：胃腸炎型、傷寒型、和敗血癥型ADDINNE.Ref.{28F219DA-F041-45FD-AE44-78DAFBC940B8}(PietroandMastroeni,2006)。胃腸炎型：通常在攝入沙門氏菌后12至48小時內(nèi)發(fā)生，表現(xiàn)為惡心和痙攣性腹痛，隨后出現(xiàn)腹瀉、發(fā)燒，有時還會嘔吐ADDINNE.Ref.{0DC712C1-4FC2-4A3F-84D5-070E79F17B99}(Bar-Meiretal.,2010)。該病的癥狀通常較輕，而嚴(yán)重者則可發(fā)生嚴(yán)重脫水。沙門氏菌引起的腸胃炎病程為2至5天，偶爾會有更嚴(yán)重的延長，而年老體弱者則可持續(xù)較長時間。傷寒型：多由鼠傷寒沙門氏菌或豬霍亂沙門氏菌等引起，感染時會出現(xiàn)類似傷寒的癥狀，不同于傷寒的是其病情較輕。傷寒型的病程一般為1～3周，雖腹瀉明顯，但很少并發(fā)腸出血和腸穿孔。敗血癥型：多發(fā)生于抵抗力較弱的人群，如兒童或已經(jīng)患有慢性疾病的成年人、老年人ADDINNE.Ref.{6E910163-C828-46B2-AFC6-27FB3786832E}(Leetal.,2009)。各類沙門氏菌均可引起發(fā)病，但豬霍亂沙門氏菌經(jīng)過食物或口部進(jìn)入后，不使腸道產(chǎn)生病變的情況下在感染的早期就能侵入血液ADDINNE.Ref.{7AED854F-6186-4640-8240-2BE7D2E9D97E}(Nietfeldetal.,1992)。通常發(fā)病的速度較快，病人出現(xiàn)嚴(yán)重發(fā)熱、畏寒、出汗、頭暈乏力等表現(xiàn)，持續(xù)的時間可能達(dá)到數(shù)天甚至一周，部分患者出現(xiàn)腸道外部位的局灶性感染，如關(guān)節(jié)炎、骨髓炎、腦膜炎、腎盂腎炎等，病變部位的感染為化膿性炎癥，有不同程度的組織壞死及膿腫形成ADDINNE.Ref.{193E76C0-238E-4B23-AE7A-07AE59D3473D}(Sharieffetal.,2005)。1.1.2禽沙門氏菌病禽沙門氏菌病，是由沙門氏菌屬種的一種沙門氏菌所引起的禽類的急性或慢性疾病的總稱。禽沙門氏菌病在世界各地普遍存在，具有重大的公共衛(wèi)生學(xué)意義，同時養(yǎng)禽業(yè)具有相當(dāng)程度的危害性。在所有感染沙門氏菌可能性的動物中，家禽有較高的感染率。根據(jù)歐盟國家沙門氏菌流行病學(xué)分析的結(jié)果，蛋雞沙門氏菌感染率可高達(dá)79.5％，肉雞沙門氏菌感染率可高達(dá)68.2％。腸炎沙門氏菌是受感染的禽類中最常見的血清型，分離率為37％ADDINNE.Ref.{60D6D195-6CA2-4E4B-A746-3A51CA85F56B}(Afsharietal.,2018)。由雞白痢沙門氏菌所引起的稱為雞白痢，由雞傷寒沙門氏菌引起的被稱為禽傷寒，有其他有鞭毛能運(yùn)動的沙門氏菌所引起的禽類疾病則統(tǒng)稱為禽副傷寒。據(jù)有關(guān)報道，被沙門氏菌污染的禽蛋引起的每年造成的經(jīng)濟(jì)損失已達(dá)4400萬美元ADDINNE.Ref.{7FC1C919-5D1E-4FE6-89F2-31B7B10B0390}(RobertsandSockett,2015)?？梢钥闯錾抽T氏菌不僅會造成畜禽疾病和死亡，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，而且還會引起人的食物中毒甚至死亡，嚴(yán)重危害公共健康。因此，對禽感染沙門氏菌進(jìn)行研究對禽業(yè)和公共衛(wèi)生安全具有重要意義。雞白痢雞白痢是由雞白痢沙門氏菌引起的傳染性疾病，全世界各地的養(yǎng)禽業(yè)均有不同程度的發(fā)生，對養(yǎng)禽業(yè)造成了嚴(yán)重的危害ADDINNE.Ref.{1E4A01E8-0714-444E-8135-B87844612DB2}(Prasannaetal.,2003)。雞白痢沙門氏菌是一種革蘭氏陰性菌，屬于兼性厭氧菌，菌體呈兩端稍圓的細(xì)長桿狀，沒有莢膜且不存在芽孢ADDINNE.Ref.{7F3A6FD3-1DFC-44EE-9B8A-120A3F798D29}(Pevzneretal.,1981)。感染雞白痢沙門氏菌的雞內(nèi)臟中都存在病菌，其中在肝臟、肺臟、卵黃囊以及睪丸中含菌量最高ADDINNE.Ref.{58D0BED0-D5B0-4F2E-8079-1D51AD7D669C}(Berchierietal.,2001)。各個品種和年齡的雞都是雞白痢的易感群體，而其對雛雞的危害尤為巨大，可引起剛剛出殼的雛雞大規(guī)模的發(fā)病或死亡。出殼雛雞在幾天內(nèi)就能呈現(xiàn)出明顯的癥狀。通常認(rèn)為雞白痢沙門氏菌主要侵染2-3周齡的雛雞，這使得雛雞的成活率降低ADDINNE.Ref.{08058553-6C9C-4376-9581-FEA8A9A18CA2}(Gengetal.,2016)。感染雞白痢的雞表現(xiàn)為：精神萎靡不振，絨毛不整松亂，雙翅無力且下垂，頭頸后縮，閉眼昏睡，擁擠在一起不愿走動。進(jìn)食在感染患病初期逐漸減少，而后停食，多數(shù)出現(xiàn)軟嗉囊癥狀。雞會因感染雞白痢沙門氏菌而發(fā)生腹瀉，排稀薄白色漿糊狀糞便，糞便粘連到附近而造成污染。泄殖腔被干結(jié)的糞便封住，可能造成附近的炎癥而引起劇烈的疼痛，這種情況會使雞發(fā)出尖銳的叫聲，最后因呼吸困難及心力衰竭而死亡。雞白痢沙門氏菌對外界的抗性較強(qiáng),在適宜的環(huán)境內(nèi)甚至可以存活7年以上，在土壤中也可以存活1年左右的時間，在病死雞的尸體中可以存活3個月。該菌耐熱性不強(qiáng)，100℃沸水5min即可滅菌，在70℃下經(jīng)過20min也可以殺滅病原菌。常規(guī)的消毒劑產(chǎn)品就能殺滅雞白痢沙門氏菌。在雞白痢的防治中盡快隔離并治療患病的雞。首先將病雞隔離并全方位地對養(yǎng)雞場進(jìn)行消毒處理，從而減少雞白痢沙門氏菌傳播。可以對飲用水煮沸消毒或添加消毒劑，以防止疾病通過消化道傳播?；疾〉墓u不再用于配種，因?yàn)殡u患雞白痢沙門氏菌的可能性與種雞的陽性率有關(guān)，而且雞白痢沙門氏菌可以通過精液傳播給母雞，最終產(chǎn)生陽性率更高的雛雞ADDINNE.Ref.{84FAC7E6-1EAF-406D-A113-E8221599B32C}(Cariouetal.,2013)。此外，應(yīng)給雛雞喂食顆粒料，以防止飼養(yǎng)員通過飲食將疾病傳播給雛雞。禽傷寒禽傷寒是由禽傷寒沙門氏菌引起的禽類感染性傳染病，它主要影響3周齡以上的家禽，在成年雞和青年雞中的發(fā)病率較高ADDINNE.Ref.{EA2B08C6-6CB6-414C-AA55-A95201759B1F}(Basnetetal.,2008)。該病主要通過消化道感染，另外通過受感染的卵垂直傳播，該病常發(fā)生在春季和冬季ADDINNE.Ref.{662231A2-E3E8-432C-A9C8-77A4CD3EF1EE}(Baoetal.,2011)。在感染后主要呈現(xiàn)為為肝、脾等器官病變、紅腫，病雞精神萎靡不振，同時伴有腹瀉，拉黃綠色糞便。當(dāng)雞染病致使肺部感染時，就會出現(xiàn)呼吸困難等一些其他的病癥。慢性病例表現(xiàn)為食欲不振，腹瀉和便秘交替出現(xiàn)，病程超過8天，死亡的情況出現(xiàn)較少，且多數(shù)轉(zhuǎn)為感染雞。特征性病變是肝臟異常增大，肝臟顏色呈棕綠色或淡古銅色。受污染的種蛋可感染雛雞，與雞白痢的病理特征和癥狀相似。有關(guān)禽傷寒的防治，磺胺類藥物是特效藥，抗生素也有一定效果，其主要依靠藥品預(yù)防、檢疫、淘汰等綜合防控措施ADDINNE.Ref.{170F3180-97D2-4AF7-8DF5-FA37728A4041}(Zhouetal.,2014)。禽副傷寒禽副傷寒是由自身帶有鞭毛且能夠運(yùn)動的沙門氏菌（如腸炎沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌等）所引起的一種傳染病，通常是除雞白痢和禽傷寒沙門氏以外的沙門氏菌引起的ADDINNE.Ref.{54D4AB04-7E37-4263-BAAB-D2A79531F943}(Hasanetal.,2005)。其病原菌在形態(tài)上比雞白痢沙門氏菌粗短，兼性厭氧菌。禽副傷寒的主要威脅對象是雛雞，在成年雞中呈現(xiàn)慢性疾病或陰性感染。禽副傷寒主要感染消化道，也會出現(xiàn)垂直轉(zhuǎn)播的情況。家禽可以被飼料、籠具、水槽中的沙門氏菌所污染，而偶爾經(jīng)卵巢直接傳遞。在產(chǎn)蛋過程中，蛋殼上沾染了含有病原菌的體液或糞便，這是一種常見的傳播途徑。感染常發(fā)生在孵化后2周內(nèi)，6-10天達(dá)到高峰ADDINNE.Ref.{4D9AF0EE-D33A-4B3C-9290-DAAD838018F2}(Saadetal.,2018)。病死率與家禽遺傳背景、飼養(yǎng)條件等均有聯(lián)系，最高能到達(dá)20%，正常條件下1月齡以上的家禽一般不引起死亡。受感染的病死雛雞消瘦脫水，卵黃凝固，肝脾出現(xiàn)條紋狀出血或點(diǎn)狀壞死。以腎充血、心包炎伴粘連性病變、卵黃化膿壞死性病變?yōu)樘卣?。成年雞也可能出現(xiàn)關(guān)節(jié)炎，成年雞慢性攜帶者主要有體重減輕，腸壞死和潰瘍，肝、脾、腎腫脹、心臟結(jié)節(jié)卵巢、心肺的病理改變不如白色痢疾常見。在自然情況下成年家禽為慢性的帶菌體，菌類主要在腸道中進(jìn)行定殖，也可能在內(nèi)臟中有所發(fā)現(xiàn)，其并沒有明顯癥狀，帶菌雞的糞便是最常見的細(xì)菌來源ADDINNE.Ref.{5B8FD312-0843-44C0-80D4-6F6BD4B19774}(JonesandD.,1945)。1.1.3家禽菌感沙門氏菌機(jī)制研究進(jìn)展沙門氏菌存在垂直傳播的情況，但主要通過糞口途徑感染家禽。家禽在感染沙門氏菌后，巨噬細(xì)胞會吞噬侵入的沙門氏菌，但這不能摧毀細(xì)菌。因此，沙門氏菌可以通過巨噬細(xì)胞進(jìn)入血液，然后到達(dá)各個重要器官，當(dāng)達(dá)到不能繁殖的卵泡時，就會造成蛋的污染ADDINNE.Ref.{00CA46D1-E64D-440A-A93F-A7C42DA6953A}(Erikssonetal.,2003)。沙門氏菌能夠侵染腸上皮細(xì)胞。在顯微鏡下觀察到，部分鼠傷寒沙門氏菌可通過依賴于鞭毛的推進(jìn)方式在黏液層附近游離，在盲腸中黏液層僅能覆蓋腸道隱窩的底部，這在上皮和黏液層之間造成了無覆蓋的空間，這造成了盲腸對沙門氏菌的易感性ADDINNE.Ref.{F58B0F62-82F0-459F-8F70-077AB44C4F28}(Zhangetal.,2009)。因此，目前禽類細(xì)胞與沙門氏菌相互作用的研究模型主要包括腸道細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和卵泡顆粒細(xì)胞。主要圍繞免疫相關(guān)功能基因的表達(dá)、腸道生理結(jié)構(gòu)的分析、細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞增殖速度、生物信息學(xué)分析對沙門氏菌感染的細(xì)胞、組織、個體進(jìn)行分析。腸道免疫屏障能抵抗常見病原體，但沙門氏菌可侵入腸粘膜上皮并在其中增殖、穿透深層組織或侵入巨噬細(xì)胞，并攜帶到其他組織器官，引起宿主體液免疫和細(xì)胞免疫ADDINNE.Ref.{90879AD6-4E8C-46B7-9777-1459FF7800F7}(Satpathyetal.,2013)。目前，研究沙門氏菌的致病機(jī)制主要采用腸道感染模式。Berndt等人采用4種血清型的沙門氏菌，研究不同禽類沙門氏菌對盲腸的侵襲能力和免疫應(yīng)答。研究表明，各類沙門氏菌的血清型都可以侵染腸上皮細(xì)胞，在盲腸粘膜層均可檢測到，但不同的血清型的侵襲能力也有所不同。腸炎沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌存在于盲腸上皮、上皮下層和基底層，其中穿透能力最強(qiáng)的是腸炎沙門氏菌，到達(dá)盲腸粘膜固有層最深A(yù)DDINNE.Ref.{4A069001-97A3-43B6-AEFF-CF7FEB89A89B}(Berndtetal.,2008)。雞盲腸組織中顆粒細(xì)胞、CD8+細(xì)胞、TCR14細(xì)胞的數(shù)量及IL-12、IL-18、INF-OUINOS的表達(dá)與不同血清型對粘膜固有層的侵襲呈正相關(guān)，而TCR2+細(xì)胞、CD4+細(xì)胞、IL-2的表達(dá)與腸上皮細(xì)胞感染時間呈正相關(guān)ADDINNE.Ref.{390322F7-2C7C-49CC-9C7B-55C3D7DDFA77}(Hernández-Ramírezetal.,2019)。說明不同血清型沙門氏菌與禽類組織相互作用的免疫應(yīng)答與細(xì)菌的穿透能力和感染時間密切相關(guān)。有研究比較了肉雞、來航雞等不同品系雞盲腸對腸炎沙門氏菌免疫應(yīng)答的差異。IL-12α、IL-12β和CCLi2的表達(dá)水平肉雞顯著高于來航雞，說明不同家禽品系對腸炎沙門氏菌的抵抗力不同，產(chǎn)生的免疫應(yīng)答程度不同ADDINNE.Ref.{FB9F7FAF-CACB-4E9D-A22D-4ADAF0B87C40}(Cobleetal.,2010)。在免疫過程中，有效的免疫力需要巨噬細(xì)胞和多形核白細(xì)胞（鳥類中大部分為嗜異性粒細(xì)胞）的激活A(yù)DDINNE.Ref.{D88BD449-B3C7-4958-A366-E17FE9CBB433}(Khiljietal.,2018)。腸道中的上皮細(xì)胞，組織中的巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞通過使用模式識別受體（PRR）,如Toll樣受體（TLR）識別保守的“病原相關(guān)模式分子”（PAMP）來激活A(yù)DDINNE.Ref.{81081E11-89B4-4486-B10E-80023FB946C2}(Taoetal.,2015)。雞在沙門氏菌中的感染中，主要的PAMP是DNA中的脂多糖（LPS），鞭毛蛋白和未甲基化的CpG基序。TLR4被LPS激活，TLR5被鞭毛蛋白激活，盡管TLR9不存在于雞基因組中，但這種識別能力由雞TLR21來實(shí)現(xiàn)ADDINNE.Ref.{B9614789-6EA1-4974-A2B7-1667684621B6}(Brownlieetal.,2009)。所有這些TLR-PAMP相互作用對于誘導(dǎo)上皮細(xì)胞，對于巨噬細(xì)胞和PMN細(xì)胞中的應(yīng)答都很重要。一系列細(xì)胞因子和趨化因子被證明在感染不同沙門氏菌血清型的不同階段以及在不同年齡或品系的雞體內(nèi)轉(zhuǎn)錄上調(diào)。促炎細(xì)胞因子如IL-1和IL-6在感染早期具有升高的特點(diǎn)，常伴有干擾素-γ(IFN-γ)編碼mRNA的上調(diào)ADDINNE.Ref.{7176DFC4-21BA-4696-A59D-0224095D78E9}(Packialakshmietal.,2016)。許多沙門氏菌血清型的感染情況表明，獲得性免疫反應(yīng)在清除原發(fā)感染和增強(qiáng)清除繼發(fā)感染方面起著重要作用ADDINNE.Ref.{108CCCC5-7929-455C-876D-262FB31C3256}(Seibertetal.,2009)。禽類暴露于各種沙門氏菌血清型的感染會刺激強(qiáng)烈的T細(xì)胞反應(yīng)，T細(xì)胞反應(yīng)主要由產(chǎn)生IFNγ的細(xì)胞主導(dǎo)，CD8+TcRαβT細(xì)胞、TcRγδT細(xì)胞也產(chǎn)生IFNγADDINNE.Ref.{2479D719-2F68-47F8-A6ED-27A937B18F2F}(Zechmannetal.,2013)。干擾素γ主導(dǎo)的反應(yīng)類型與在感染沙門氏菌的哺乳動物宿主中發(fā)現(xiàn)的反應(yīng)非常相似。1.2轉(zhuǎn)錄組學(xué)1.2.1基本定義轉(zhuǎn)錄組（transcriptome)的定義是指生物體特定類型的細(xì)胞中全體轉(zhuǎn)錄本（transcript）的總和。在轉(zhuǎn)錄組中，既包括可以編碼蛋白的信使RNA(mRNA)，同時也包括不編碼蛋白各類非編碼RNA。這些RNA轉(zhuǎn)錄本在細(xì)胞中協(xié)同互作，共同調(diào)控細(xì)胞的生長、發(fā)育、凋亡等一系列重要的生理過程。通過轉(zhuǎn)錄組，可以將包含遺傳信息的基因組和生物功能的蛋白質(zhì)組聯(lián)合起來，轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控是目前研究最為廣泛，也是機(jī)體最為重要的調(diào)控方式。RNA-seq中差異基因表達(dá)的研究能夠比較來自不同組織和條件的基因表達(dá)譜，以鑒定在表型確定中起主要作用的基因，揭示特定生物學(xué)過程中的分子機(jī)理。例如，對健康組織和患病組織的比較可以為病理學(xué)涉及的遺傳變量提供新的見解。1.2.2轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究方法歷程概述轉(zhuǎn)錄組的研究從20世紀(jì)90年代初逐漸興起，高通量測序技術(shù)的出現(xiàn)使RNA測序在一定程度內(nèi)得以實(shí)現(xiàn)。傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄組研究方法包括表達(dá)序列標(biāo)簽技術(shù)（ExpressedsequenceTags，EST）、基因表達(dá)序列分析（Serialanalysisofgeneexpression，SAGE）、基因芯片技術(shù)（Microarray）和大規(guī)模并行測序技術(shù)（Massivelyparallelsignaturesequencing，MPSS）ADDINNE.Ref.{A35F6DE3-EF2C-4447-A201-C6E0C1E3A6D8}(Wangetal.,2010)。最早由Adams等人于1991年提出EST技術(shù)，于人類基因組計(jì)劃開始逐漸形成。EST是從一個隨機(jī)選擇的cDNA克隆進(jìn)行5’端和3’端單一次sanger測序獲得的短的cDNA部分序列，代表一個完整基因的一小部分，在數(shù)據(jù)庫中其長度一般從20到7000bp不等，平均長度為360±120bp。EST來源于一個特定時間或環(huán)境下的某個組織總mRNA所構(gòu)建的cDNA文庫，因此EST在一定程度上也能說明該組織中各基因的表達(dá)水平ADDINNE.Ref.{535AB16A-59AE-48EA-BD4A-E100EBF608A8}(Buetowetal.,1999)。SAGE是1995年由Veleulesce等建立的一種新的基因表達(dá)模式研究技術(shù)。它可以在整體水平上對細(xì)胞或組織中的大量轉(zhuǎn)錄本同時進(jìn)行定量分析，而無論其是否為已知基因。此測序技術(shù)的出現(xiàn)顯著降低了測序成本，它可以快速分析基因表達(dá)信息，而且能夠?qū)?xì)胞或者特定組織中大量的轉(zhuǎn)錄本信息進(jìn)行快速鑒定分析ADDINNE.Ref.{D42842EE-652C-4EB2-AE9F-CD108863F598}(ColingeandFeger,2001)。微陣列（microarray），又可以稱之為基因芯片技術(shù)，在高通量測序之前是主要的高通量轉(zhuǎn)錄本表達(dá)分析技術(shù)，其由幾十萬個不等的探針（probe）分子固定在約1cm見方的固體片基上制成。利用核苷酸分子在形成雙鏈時堿基互補(bǔ)配對原理，使用微陣列可以一次性檢測出樣本中所有與探針互補(bǔ)的核苷酸片段，從而快速得到所測樣本中基因的表達(dá)譜ADDINNE.Ref.{2311F216-5D77-47B1-A6AF-FD2347B1974E}(Brazmaetal.,2001)。而在測序過程中基因芯片的檢測范圍取決于基因芯片上的探針信息，因此基因芯片通常用于檢測特定片段的表達(dá)量。盡管在定量轉(zhuǎn)錄組學(xué)中廣泛應(yīng)用，但這些技術(shù)有幾個局限性：（1）探針設(shè)計(jì)依賴于基因組的先驗(yàn)知識；（2）只監(jiān)測已知基因的某些部分而不是所有轉(zhuǎn)錄rna的實(shí)際序列的可能性；（3）準(zhǔn)互補(bǔ)序列間的不完全雜交；（4）由于背景噪聲和信號飽和，動態(tài)范圍有限；（5）需要規(guī)范化來比較來自不同數(shù)組的數(shù)據(jù)。傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究方法早已不能滿足當(dāng)今生命科學(xué)研究的需要，而隨著轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究技術(shù)和需求的發(fā)展，高通量測序(High-ThroughputSequencing,HTS)技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。高通量測序是對傳統(tǒng)Sanger測序極大的變革，文中的標(biāo)點(diǎn)符號需要特別注意。其一次運(yùn)行即可同時得到幾十萬到幾百萬條核酸分子的序列，解決了一代測序一次測序只能獲得一條序列信息的限制，也被稱為新一代測序(NextGenerationSequencing,NGS)或第二代測序。羅氏在2005年推出了第一款二代測序儀羅氏454，至此生命科學(xué)開始進(jìn)入高通量測序時代。而后續(xù)Illumina系列測序平臺的推出極大降低了二代測序的價格，推動了高通量測序技術(shù)在醫(yī)學(xué)、動植物研究等生命科學(xué)各個研究領(lǐng)域的普及與應(yīng)用。第二代測序需要一次試驗(yàn)即可快速生成完整的poly-A尾的RNA完整序列信息，并分析基因表達(dá)、剪接位點(diǎn)、cSNP、新轉(zhuǎn)錄本、異構(gòu)體、等位基因特異性表達(dá)等最全面的轉(zhuǎn)錄組信息。簡單的樣品制備和數(shù)據(jù)分析軟件支持在所有物種中的mRNA測序研究ADDINNE.Ref.{D4161495-B16D-4ED8-8687-A5FD2848E525}(Royetal.,2011)。雖然第二代測序技術(shù)測序的通量遠(yuǎn)高于一代測序技術(shù)，但其測序獲得的單條序列長度有限，想要得到準(zhǔn)確的序列信息依然依賴于較高的測序覆蓋度和準(zhǔn)確的序列拼接技術(shù)，因此在二代測序的結(jié)果中依然有可能存在一些技術(shù)性的錯誤。文中的標(biāo)點(diǎn)符號需要特別注意。第三代測序技術(shù)也稱為單分子測序技術(shù)，該技術(shù)在保證測序通量的基礎(chǔ)上，對單條長序列進(jìn)行從頭測序，能夠直接得到長度在數(shù)萬個堿基的核酸序列信息ADDINNE.Ref.{B69AC5BC-4D1E-48D3-AC4D-DC3AD8BF9BC0}(Schadtetal.,2010)。1.2.3RNA-seq的數(shù)據(jù)分析RNA-seq的測序框架能以高分辨率研究樣品中存在的所有RNA，同時表征其序列并定量其豐度。實(shí)際上，從輸入RNA的隨機(jī)位置開始對數(shù)百萬條短序列（稱為“reads”）進(jìn)行測序，然后可以將這些讀段通過計(jì)算方式映射到參考基因組上，以揭示轉(zhuǎn)錄圖譜，其中與每個基因?qū)R的讀段數(shù)量可以衡量其表達(dá)水平。RNA-seq優(yōu)良的特性（例如高分辨率和寬動態(tài)范圍）推動了轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究的空前發(fā)展，在全球范圍內(nèi)產(chǎn)生了大量數(shù)據(jù)。為了支持這種指數(shù)級增長并應(yīng)對數(shù)據(jù)分析的不同步驟，已經(jīng)開發(fā)和更新了大量分析工具ADDINNE.Ref.{DF41CB91-3BFC-465C-8ACC-A2FF55F70CCB}(Sahraeianetal.,2017)。目前已經(jīng)提出了三種主要方法用于使用RNA-seq推斷RNA樣本中表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本集合。：最簡單的方法是使用經(jīng)過整理的注釋，假設(shè)樣本中的轉(zhuǎn)錄本是經(jīng)過整理數(shù)據(jù)庫中列出的轉(zhuǎn)錄本的子集，例如EnsemblADDINNE.Ref.{84C9CE32-1168-4509-9AB5-C1435846FEC1}(Fliceketal.,2010)。將reads與參考基因組或轉(zhuǎn)錄組序列比對，利用統(tǒng)計(jì)模型估計(jì)表達(dá)差異性。另一種方法涉及將reads與參考基因組比對，在轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)庫的幫助下重新推斷轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)。最具挑戰(zhàn)性的方法是在沒有參考數(shù)據(jù)的幫助下將reads從頭組，從頭組裝最有效地應(yīng)用于發(fā)現(xiàn)特征較弱或缺乏參考基因組的物種中表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本。對使用整理過的注釋、基因組引導(dǎo)重建或從頭重建的RNA-seq數(shù)據(jù)的分析方法的比較。有研究已經(jīng)證明，即使注釋質(zhì)量相當(dāng)?shù)?，注釋也會比轉(zhuǎn)錄組重建方法產(chǎn)生更準(zhǔn)確的基因表達(dá)估計(jì)ADDINNE.Ref.{E2A3959A-4BDC-4BB9-A854-D7149E9989F3}(Engstr?metal.,2013a)。主要原因是純計(jì)算重建策略的靈敏度和精確度低，即使在參考基因組的輔助下也是如此。對于從頭組裝和基因組引導(dǎo)的讀取組裝，在重建中會遺漏樣本中存在的許多轉(zhuǎn)錄物ADDINNE.Ref.{CE1BFB24-8D98-45A7-B23D-5937FC1123E5}(Manguletal.,2012)。正確重建的轉(zhuǎn)錄物的模擬和估計(jì)表達(dá)值之間的相關(guān)性很高，但似乎這是由少量高表達(dá)的轉(zhuǎn)錄物所影響的ADDINNE.Ref.{61183713-84F7-4C67-9025-B940D67AEBA9}(Trapnelletal.,2011)。在逐個位點(diǎn)的基礎(chǔ)上使用算法重建注釋的方法，可能有利于在轉(zhuǎn)錄組中尋找注釋良好的全新元素。具體地說，利用算法重建轉(zhuǎn)錄本可以用于與現(xiàn)有的注釋強(qiáng)烈矛盾的情況，例如有高RNA-Seq計(jì)數(shù)但沒有基因注釋的區(qū)域，并且對于這些區(qū)域，重新構(gòu)建與組裝轉(zhuǎn)錄本比不重建更好。通過使用幾種方法檢測到的重建轉(zhuǎn)錄本，也可以使計(jì)算預(yù)測更加保守ADDINNE.Ref.{960E52E8-6A39-4CF8-8B92-226DB4554CE7}(Schulzetal.,2012)。在分析來自沒有參考基因組的未注釋物種的數(shù)據(jù)時，可以考慮使用來自密切相關(guān)物種的注釋。研究結(jié)果，RNA樣品中轉(zhuǎn)錄物序列的準(zhǔn)確度最終將取決于新興的無片段化測序技術(shù)，該技術(shù)中的閱讀長度可以與轉(zhuǎn)錄物長度匹配。但是，由于目前此類技術(shù)的通量仍然較低，此步驟可能需要使用定制的寡核苷酸捕獲試劑盒去除高表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本，以確保對低表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行測序ADDINNE.Ref.{CF6D9604-B979-4C2C-BC07-78CEF121147B}(Labajetal.,2011)。文獻(xiàn)引用有誤。使用長reads技術(shù)來識別樣品中獨(dú)特的轉(zhuǎn)錄本，結(jié)合高通量短reads技術(shù)來估計(jì)表達(dá)水平，可能是暫時準(zhǔn)確鑒定RNA樣品的最??佳方法。文獻(xiàn)引用有誤。如果有注釋良好的參考基因組或轉(zhuǎn)錄組，并且如果RNA-seq研究的目的是檢測DE基因，則基本數(shù)據(jù)處理流程包括以下步驟：（i）reads的比對，（ii）count定量，（iii）數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化和（iv）檢測差異表達(dá)基因。序列reads比對RNA-seq數(shù)據(jù)分析流程的第一步是讀取表達(dá)圖譜：通過識別與讀取序列匹配的基因區(qū)域，將讀取序列與參考基因組或轉(zhuǎn)錄組對齊。比對過程通常始于建立參考基因組或reads的索引，然后將其用于快速檢索參考序列中reads更可能對齊的位置組。一旦確定了可能的映射位置，就可以使用較慢和更靈敏的算法在這些候選區(qū)域中進(jìn)行比對ADDINNE.Ref.{6699989D-20AE-4B1F-8B98-5887D93BE25B}(Hatemetal.,2013)。由于NGS數(shù)據(jù)中存在測序錯誤，因此比對算法必須允許不完全的比對。通過容忍一定數(shù)量的失配來增加映射讀取的百分比ADDINNE.Ref.{36230BB8-6CEF-4A37-9379-C1D0B5D17503}(Engstr?metal.,2013b)。比對所使用的工具實(shí)現(xiàn)了截然不同的不匹配策略，通常允許用戶指定自定義的參數(shù)設(shè)置，不匹配策略對比對精度和計(jì)算性能有很大影響，其最佳配置的定義也取決于實(shí)際操作的情形?；虮磉_(dá)量的定量比對后，與每個編碼單元(如外顯子、轉(zhuǎn)錄本或基因)對齊的reads被用來計(jì)算表達(dá)量，從而給出其表達(dá)水平的估計(jì)。最常用的方法是考慮與基因外顯子重疊的讀取總數(shù)。但即使在注釋良好的生物體中，也有一小部分reads位于已知外顯子的邊界之外ADDINNE.Ref.{CDC6AA45-3B28-44BE-B203-C76F54246209}(Pickrelletal.,2010)。因此，另一種策略考慮了基因的全長，也計(jì)算了內(nèi)含子的reads。如上所述，在分析流程中通常通過兩個計(jì)算步驟對RNA-seq數(shù)據(jù)中的基因表達(dá)進(jìn)行定量：將reads與參考基因組或轉(zhuǎn)錄組對齊，然后根據(jù)對齊的reads對基因豐度進(jìn)行估算。由于最常用的RNA-Seq技術(shù)產(chǎn)生的reads通常要短于從其取樣的轉(zhuǎn)錄本。因此在存在具有相似序列的轉(zhuǎn)錄本的情況下，并非總是可能將reads獨(dú)特地分配給特定基因。RNA-seq中不可忽略的一部分是“multireads”：以一定程度的的保真度比對到參照的多個位置的reads。Multireads在總比對到的reads中所占的比例取決于轉(zhuǎn)錄組的復(fù)雜性和reads長度，從10％到>50％不等ADDINNE.Ref.{BDA8333D-1D37-4D8E-9C45-4B91322C898C}(DeweyandLi,2011)。處理multireads的首要策略之一是忽視它們，因此僅考慮獨(dú)特的比對reads就可以估算基因表達(dá)，而丟棄multireads可能會導(dǎo)致信息丟失，并導(dǎo)致重復(fù)區(qū)域?qū)?yīng)的表達(dá)水平被低估。定量數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)化在評估差異基因表達(dá)之前需要仔細(xì)標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)以糾正不同的來源偏差。要考慮的第一個偏差是樣品的“測序深度”，定義為測序或映射讀數(shù)的總數(shù)。Robinson等提出了“M值的均方差”（TrimmedMeanofM-values，TMM）歸一化方法，以解決樣本之間庫組成的差異ADDINNE.Ref.{DF53D5A6-0508-491A-903F-7EC685AA1584}(RobinsonandOshlack,2010)。在R包‘DESeq’中，計(jì)算每個樣本中的基因計(jì)數(shù)與所有樣本中的基因計(jì)數(shù)的幾何平均值之間的比率，并且將文庫大小設(shè)定為比率的中位數(shù)ADDINNE.Ref.{BFACB945-9580-4048-9334-32946117C902}(Loveetal.,2014)。有研究表明TMM和‘DESeq’方法是數(shù)據(jù)大小歸一化最有效的方法ADDINNE.Ref.{81128EB2-0BFA-433E-A640-CF9D8604461C}(AndersandHuber,2010)。RNA-seq計(jì)數(shù)也收到基因長度偏差的影響：定位在基因上的預(yù)期reads數(shù)與從該基因轉(zhuǎn)錄的異構(gòu)體的豐度和長度成正比。實(shí)際上，較長的基因比較短的基因產(chǎn)生更多的reads，從而導(dǎo)致差異表達(dá)檢測的能力更高。為了減少這種統(tǒng)計(jì)上的偏差，有人提出將比對的reads總結(jié)為“ReadsPerKilobaseperMillionmappedreads”（RPKM），即代表每百萬reads中來自于某基因每千堿基長度的reads數(shù)ADDINNE.Ref.{D839A783-1FC7-4299-A2DA-2C773967DAD7}(Wagneretal.,2012)。RPKM是將比對到基因的read數(shù)除以比對到基因組上的所有read數(shù)(以million為單位)與RNA的長度(以KB為單位)?！癋ragmentsPerKilobaseperMillionmappedreads”（FPKM）考慮了成對末端的數(shù)據(jù)，并根據(jù)預(yù)期的片段數(shù)估計(jì)了轉(zhuǎn)錄本的豐度，應(yīng)用于雙端測序結(jié)果。定義RPKM和FPKM是為了減少庫大小和長度偏差的差異。差異表達(dá)的檢驗(yàn)對于RNA-seq數(shù)據(jù)的特定統(tǒng)計(jì)模型，差異表達(dá)分析的所有工具主要包括兩個步驟：從數(shù)據(jù)中估計(jì)模型參數(shù)和用檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)方法檢測差異表達(dá)基因?；谪?fù)二項(xiàng)分布（NegativeBinomial）的工具有更高的性能。EdgeR和DESeq在大多數(shù)比較研究中表現(xiàn)最好，它們都基于NB模型，但實(shí)施了不同的離散度估計(jì)策略ADDINNE.Ref.{03AB215A-0B40-45C5-A404-96CC7608298E}(Robinsonetal.,2010)。1.2.4轉(zhuǎn)錄組測序在家禽中的應(yīng)用隨著轉(zhuǎn)錄組學(xué)和分子遺傳學(xué)技術(shù)的發(fā)展，生命科學(xué)的研究在諸多方面都已經(jīng)將轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)用于常規(guī)的研究方法，如醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域、植物研究領(lǐng)域、微生物研究領(lǐng)域、動物研究領(lǐng)域等。近年來，轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)在家禽研究起到了越來越多的作用在家禽肉、蛋生產(chǎn)、遺傳機(jī)制、抗病性狀等方面均有大量的應(yīng)用，而這些研究中的部分結(jié)果又將反饋于生產(chǎn)，應(yīng)用于育種工作和生產(chǎn)，提高家禽業(yè)的生產(chǎn)效率。朱云以舊院黑雞作為實(shí)驗(yàn)對象,為了研究蛋雞法氏囊發(fā)育的分子機(jī)制，分別對7、42、90、120日齡的法氏囊組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，并從中篩選出重要的差異表達(dá)基因，并利用GO和KEGG富集分析得出在7-120日齡,差異基因與免疫應(yīng)答、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡相關(guān),主要是一些炎癥因子和凋亡因子，于細(xì)胞黏連、細(xì)胞吞噬、細(xì)胞凋亡的信號通路也有一定聯(lián)系。Ferdous將高靈敏的RNA測序技術(shù)首次用于分析血小板的完整轉(zhuǎn)錄組。經(jīng)明尼蘇達(dá)沙門氏菌的脂多糖體外刺激1h后，490個基因上調(diào)，359個基因下調(diào)，與未刺激的血小板相比，至少有1倍的變化。這項(xiàng)研究有助于開發(fā)新的沙門氏菌感染解決方案，以降低鳥類和魚類傳染病帶來的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和人畜共患病威脅ADDINNE.Ref.{75D1562D-C30E-46F3-9775-EBFA56190145}(Farzanaetal.,2016)。MelissaS.Deist首次使用RNA-seq分析哈德爾氏腺轉(zhuǎn)錄組。兩個不同雞品系的哈德氏腺對新城疫病毒的反應(yīng)在差異表達(dá)基因數(shù)量和可檢測到的新城疫病毒數(shù)量上有很大差異。在未受到感染的Fayoumi雞中激活的通路表明，在未感染條件下，相對于來航雞免疫系統(tǒng)發(fā)展程度更高。與來航雞不同，被感染的Fayoumi在2dpi的哈德氏腺腺體中有明顯更高的病毒轉(zhuǎn)錄本計(jì)數(shù)，但在6dpi不再有可檢測到的病毒轉(zhuǎn)錄本計(jì)數(shù)。這表明Fayoumi雞可能比來航雞更快地清除病毒。哈德氏腺是滴眼接種或氣霧劑傳播病毒后的第一反應(yīng)組織ADDINNE.Ref.{50C786A2-AD0E-4E43-8C92-C067F8A4333C}(Deistetal.,2018)。MelissaS.Deist的研究為進(jìn)一步研究該組織在宿主防御中的獨(dú)特作用奠定了基礎(chǔ)。綜上所述，轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)已在家禽的生長發(fā)育、抗病性狀等諸多領(lǐng)域方面進(jìn)行了一些研究，取得了一定的進(jìn)展，是家禽在分子遺傳分析過程中的有力工具。1.3抗病遺傳育種1.3.1抗病遺傳育種的必要性中國是世界上最重要的雞生產(chǎn)與消費(fèi)國之一。目前中國禽肉占肉類總產(chǎn)量的比重為21.5%，根據(jù)美國農(nóng)業(yè)部數(shù)據(jù)，2017年美國雞肉產(chǎn)量達(dá)到1859萬噸，占全球雞肉產(chǎn)量的20.62％;中國雞肉產(chǎn)量達(dá)到1160萬噸，占全球雞肉產(chǎn)量的12.86％。2017年，美國、中國雞肉消費(fèi)量為1866.70萬噸、1205.00萬噸；2018年中國的禽肉消費(fèi)量為1902.8萬噸，是全球禽肉消費(fèi)第一大國ADDINNE.Ref.{1B00EB82-BA17-4C61-ADEA-B4D99DF8FE9A}(Xuanetal.,2018)。根據(jù)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部194號文件，自2020年1月1日起我國飼料中全面禁止添加抗生素，減少濫用抗生素造成的危害，維護(hù)動物源食品安全和公共衛(wèi)生安全。一項(xiàng)研究顯示，如果細(xì)菌抗藥性的發(fā)展趨勢得不到有效遏制，2050年超級細(xì)菌每年將導(dǎo)致約1000萬人死亡，超過每年死于癌癥的人數(shù)ADDINNE.Ref.{D980D77F-4820-4EAF-BE09-2A20D9481053}(Stephenson,1998)。在生產(chǎn)中，傳染病的相對重要性取決于它們對動物健康和生產(chǎn)的影響。在面對畜禽中的有害病原菌時，傳統(tǒng)的防治方法有注射抗生素、疫苗等，這是目前主流的治療和預(yù)防有害病原菌的手段。如果疫苗接種和抗生素等常規(guī)控制措施無效、不可持續(xù)或不經(jīng)濟(jì)，則考慮采用一般性的疾病控制方法。對于細(xì)菌性疾病，當(dāng)前面臨的重要問題是部分細(xì)菌已經(jīng)對抗生素產(chǎn)生或正在生成耐藥性，抗生素治療的效果越來越差。沙門氏菌為腸桿菌科中最常見的人畜共患病原菌之一。近年來由于抗生素在獸醫(yī)臨床上的大量應(yīng)用，導(dǎo)致多重耐藥沙門氏菌菌株不斷出現(xiàn)，已經(jīng)給家禽養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因此畜禽抗病品系的篩選和培育具有重要的研究意義。通過對畜禽的抗病遺傳育種提高畜禽遺傳抗病能力，可以對傳統(tǒng)畜禽疾病防控手段進(jìn)行必要的補(bǔ)充，抗病育種現(xiàn)在已經(jīng)成為減少疾病損失、提高畜禽產(chǎn)量的研究熱點(diǎn)。這部分可與上一段合并。1.3.2抗病育種遺傳基礎(chǔ)這部分可與上一段合并。由于畜禽自身免疫系統(tǒng)的作用，當(dāng)畜禽接觸病原菌時，身體會產(chǎn)生相應(yīng)的應(yīng)激，這種抵御細(xì)菌感染的能力變成了抗病力。這種個體特有的抗病能力不僅可以遺傳給后代，而且世代之間存在遺傳變異，因此可以通過使用選擇性育種技術(shù)來提高群體和群體水平的整體遺傳抗性水平。在數(shù)量遺傳學(xué)中抗病力被認(rèn)為是低、中等遺傳力水平的數(shù)量性狀，而這種抗病力分為特殊抗病力和一般抗病力ADDINNE.Ref.{7C7EC67C-4F19-4031-8578-5AA0859AE9EE}(Campbell,1986)。特殊抗病力是指畜禽對某種特定的疾病或病原的抗性或不易感性。特殊抗病力一般主要受到一個主基因位點(diǎn)的控制，表現(xiàn)為宿主體可能內(nèi)存在或缺失某種由受該主基因位點(diǎn)控制的分子或其受體。在大多數(shù)情況下，這種單一抗性基因可以顯示出完全抗性，并顯示出與病原體基因的遺傳相互作用ADDINNE.Ref.{D47E2434-94E0-4525-A5A1-BDF894367808}(MüllerandBrem,1991)。一般抗病力并非針對某種病原體，環(huán)境和基因會對一般抗病力產(chǎn)生總體影響，病原菌的差異性對一般抗病力影響較小或幾乎沒有影響，通?？梢苑从吵鰴C(jī)體免疫系統(tǒng)對抗原的免疫反應(yīng)。一般抗病力通常涉及到獲得性免疫和先天性免疫兩個方面ADDINNE.Ref.{27D11A60-7B84-4E58-9116-26BD6F810EB9}(Westhusinetal.,2007)。1.3.3抗病遺傳育種的途徑通?？共∵z傳育種的方法有三種：抗病性狀的直接選擇；DNA分子輔助標(biāo)記間接選擇；轉(zhuǎn)基因選擇?？共⌒誀畹闹苯舆x擇通常直接選擇以數(shù)量遺傳學(xué)理論為基礎(chǔ)，在畜禽群體感染某種病原體的情況下，留取存貨或不發(fā)病的個體做種用,經(jīng)多代選擇通過表型性狀的區(qū)分即可改進(jìn)提高群體的抗病力。這種方法操作簡單，快捷高效，能夠直接的體現(xiàn)機(jī)體抗病能力差異，因此得到了普遍的應(yīng)用。但需要對選育的畜禽品種群體進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，增加了大量的育種試驗(yàn)成本，對生產(chǎn)可能也會造標(biāo)點(diǎn)符號成影響，并且一部分遺傳力低的抗病性狀使用直接選擇效果較差，所選的性狀不一定真實(shí)遺傳。這種直接選擇法在家禽的抗病育種上較為成功的例子是對雞卡氏住白細(xì)胞原蟲病的研究,研究發(fā)現(xiàn)不同遺傳背景的雞造成了有顯著差異的抗病力，不同品種的雞對卡氏住白細(xì)胞原蟲病的抵抗力并不相同ADDINNE.Ref.{2285D4E8-5AAC-4245-95C0-775FBBDD6B0D}(IsobeandYoshihara,1998)。因此通過對抗病力強(qiáng)的雞進(jìn)行人工選擇和擴(kuò)群繁殖,就可以培養(yǎng)出抗卡氏住白細(xì)胞原蟲病的品系和種群。標(biāo)點(diǎn)符號分子標(biāo)記輔助育種分子標(biāo)記輔助育種，利用分子生物學(xué)和基因組學(xué)的試驗(yàn)與研究進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選擇育種，找到與疾病或抗病力性狀關(guān)聯(lián)的標(biāo)記基因或標(biāo)記性狀是這種選擇方法的關(guān)鍵。通過定位抗病基因的主基因或數(shù)量性狀基因座(quantitativetraitlocus,QTL)，利用DNA水平的分子標(biāo)記輔助選擇，從而代替以表型性狀為區(qū)分的育種選擇,。這種方法可縮短育種過程中的世代間隔,并且提高選擇強(qiáng)度,提高選種的準(zhǔn)確性和效率,同時也大大降低了育種成本。Phua等對抗皮疹羊群和易感皮疹羊群進(jìn)行研究，使用過氧化氫酶基因?qū)d羊皮疹的抗病性、易感性進(jìn)行識別與區(qū)分，結(jié)果表明的多個與過氧化氫酶基因相關(guān)的分子標(biāo)記存在差異ADDINNE.Ref.{39E49B01-FA78-4F30-92DA-A3C5BAEEF9A3}(Phuaetal.,2014)。轉(zhuǎn)基因技術(shù)是將人工分離和修飾過的基因?qū)氲缴矬w基因組中，由于導(dǎo)入基因的表達(dá)，引起生物體的性狀的可遺傳的修飾，這一技術(shù)稱之為轉(zhuǎn)基因技術(shù)。從長遠(yuǎn)來看,在農(nóng)牧業(yè)應(yīng)用基因轉(zhuǎn)移、敲除有害基因、插入必需基因,是提高畜禽抗病力、實(shí)現(xiàn)抗病遺傳育種極有發(fā)展?jié)摿Φ念I(lǐng)域。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)進(jìn)行動物抗病性研究通常涉及4類基因：第一類基因?qū)儆谶M(jìn)化過程中天然發(fā)生的抗病基因,如MHC等位基因；第二類基因?qū)儆诓《疽職さ鞍谆?；第三類屬于人工合成基?如核酶基因；第四類是細(xì)胞