健脾清化方對(duì)慢性腎衰竭腎纖維化大鼠anadph氧化應(yīng)激通路的影響

腎纖維是所有慢性腎衰竭（kd）到最終結(jié)束的最后一個(gè)共同通道。越來(lái)越多的研究證明:氧化應(yīng)激在腎疾病進(jìn)展及其并發(fā)癥發(fā)病中起著十分重要的作用,氧化應(yīng)激存在于各種腎疾病的始末,在腎功能正常的CKD1期即已出現(xiàn),并隨著腎功能減退而不斷加重,所以深入研究氧化應(yīng)激在慢性腎衰竭進(jìn)程中的作用機(jī)制,并尋求有效的遏制手段,對(duì)延緩腎衰竭纖維化進(jìn)程具有重要意義。健脾清化方治療慢性腎衰竭已被證實(shí)具有顯著的臨床療效,我們已經(jīng)從動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的角度對(duì)其在脂質(zhì)代謝、細(xì)胞免疫、炎癥因子等方面進(jìn)行了療效機(jī)制上的研究,此次研究將著眼于健脾清化方對(duì)血管緊張素II(angiotensinII,ATII)/還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamideadeninedinucleotidephosphat,NADPH)氧化應(yīng)激通路的干預(yù)作用,以5/6腎切除(Platt法)制備大鼠慢性腎衰竭腎纖維化模型,探討健脾清化方改善腎纖維化新的作用途徑,為采用中醫(yī)藥延緩腎衰竭進(jìn)程做進(jìn)一步有益的探索。1材料和方法1.1材料表面1.1.1enfree分級(jí)健康成年雄性SD大鼠40只,無(wú)特定病原體(speceficpathogenfree,SPF)級(jí),8周齡,體質(zhì)量(200±20)g,由上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)有限公司提供。分籠飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心25℃,12h光照,45%相對(duì)濕度的環(huán)境中,自由飲水,進(jìn)食標(biāo)準(zhǔn)普通飼料。1.1.2濃縮生藥量健脾清化方水煎劑制備:黨參15g、生黃芪15g、草果仁6g、蒼術(shù)10g、黃連3g、制大黃9g,共計(jì)58g,由上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥研究所提供,水煎濃縮為生藥含量0.58g/mL。對(duì)照藥:氯沙坦鉀片,100mg/片(杭州默沙東制藥有限公司生產(chǎn),藥物批號(hào)100395),將藥研成細(xì)粉,用生理鹽水配成1mg/mL的混懸液。1.1.3全rna抽提劑及標(biāo)準(zhǔn)pcr擴(kuò)增血管緊張素II1型受體(angiotensinIItype1receptor,AT1)購(gòu)于武漢博士德生物工程有限公司(批號(hào)BA0582);β-actin購(gòu)于美國(guó)SantaCruz公司(批號(hào)sc-47778);TRIzol法全RNA抽提試劑盒購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司(貨號(hào)A2010B0A0250T);cDNA第一鏈合成試劑盒購(gòu)于美國(guó)Promega公司(貨號(hào)A2010B0B0160T);定量PCRPremix(熒光染料)購(gòu)于中國(guó)BioTNT公司(貨號(hào)A2010A0112);丙二醛(MDA)檢測(cè)試劑盒和超氧化物歧化酶(SOD)檢測(cè)試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所。1.2方法1.2.1腎切除后血胱蛋白的情況首先將40只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組8只,造模組32只。造模組大鼠32只應(yīng)用5/6腎切除(Platt法)制備慢性腎衰竭動(dòng)物模型,分兩步完成,先背部切口切除左腎2/3,縫合1周后切除整個(gè)右腎。造模動(dòng)物術(shù)后1周斷尾法采血,測(cè)定腎功能,剔除造模失敗和死亡動(dòng)物共4只后,根據(jù)腎切除后血肌酐值高低平均分組,使各組間血肌酐值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),分為模型組9只、健脾清化方組10只和氯沙坦組9只。假手術(shù)組僅在手術(shù)時(shí)打開(kāi)腎區(qū)皮膚肌肉并暴露腎。健脾清化方治療組按5.8g/(kg·d)灌胃;氯沙坦治療組按10mg/(kg·d)灌胃,用藥劑量按人體用藥量6倍進(jìn)行換算,灌胃每日1次,共60d。假手術(shù)組和模型組同體積生理鹽水灌胃。在給藥過(guò)程中,健脾清化方組和氯沙坦組各死亡大鼠1只。1.2.2質(zhì)中質(zhì)的固定末次給藥后禁食12h,腹主動(dòng)脈采血,迅速脫頸椎處死動(dòng)物,取出殘腎,冰上操作留取腎皮質(zhì),將所得殘腎皮質(zhì)分為兩部分,分別置于液氮和10%甲醛中固定。1.2.3觀察指標(biāo)和測(cè)試方法1.2.3.1.尿素氮bun和血清肌scr的檢測(cè)分離血清后采用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清中BUN和Scr的含量。1.2.3.腎組織sod和mda冰PBS液洗凈腎組織殘留血液后,取0.5g腎組織加4.5mL冰PBS制作成10%組織勻漿,低溫離心取上清液,采用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定腎組織SOD含量,采用硫代巴比妥酸法測(cè)定腎組織MDA含量。1.2.3.蛋白濃度測(cè)定大鼠腎組織稱重后,100mg組織加入1mL組織裂解液(RIPA)及蛋白酶抑制劑制備組織勻漿,10000r/min離心40min收集上清液,提取細(xì)胞總蛋白,以改良Lowry氏法測(cè)定蛋白濃度。50μg組織蛋白經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酞胺凝膠(SDS-PAGE)分離,將蛋白電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜,0.5%的牛血清白蛋白TBS(Tris堿,NaCl,pH7.5)非特異封閉,加入抗大鼠AT1抗體37℃孵育2h后4℃孵育過(guò)夜,在SP試劑盒的二抗、三抗工作液(1:20稀釋)孵育,0.5%吐溫、PBS沖洗,化學(xué)發(fā)光劑進(jìn)行曝光。用凝膠圖像分析系統(tǒng)掃描分析條帶的面積和灰度,蛋白區(qū)帶用積分灰度值表達(dá),β-actin作為內(nèi)對(duì)照。1.2.3.實(shí)時(shí)熒光定量pcr方法檢測(cè)目的基因表達(dá)量按試劑盒提示進(jìn)行RNA抽提,RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA后,–20℃冰凍保存。2μLcDNA模板,SYBRGreenI試劑25μL,上、下游引物各2μL加雙蒸水至50μL,再加石蠟油20μL,瞬時(shí)離心2s,放入實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增儀中進(jìn)行PCR反應(yīng)。擴(kuò)增產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠電泳,凝膠成像系統(tǒng)及自動(dòng)分析軟件下觀察電泳結(jié)果。目的基因相對(duì)表達(dá)量=目的基因條帶光密度/內(nèi)參照基因條帶光密度。p47phox引物由美國(guó)Invitrogen公司合成,序列如表1所示。1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:統(tǒng)計(jì)學(xué)分析a計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ue0af±s)表示,應(yīng)用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,組間比較用單因素方差分析檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1各組大鼠血清bun和scr水平與假手術(shù)組相比較,模型組、健脾清化方組和氯沙坦組血清BUN和SCr水平均明顯升高(P<0.05);與模型組相比較,健脾清化方組和氯沙坦組血清BUN和SCr水平均明顯下降(P<0.05);健脾清化方組與氯沙坦組血清BUN,SCr水平比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,表2)。2.2各組腎組織中mda和sod含量比較與假手術(shù)組相比較,模型組、健脾清化方組和氯沙坦組腎組織中MDA含量明顯升高,SOD含量明顯降低(P<0.05);與模型組相比較,健脾清化方組和氯沙坦組腎組織中MDA含量明顯降低,SOD含量明顯升高(P<0.05);與氯沙坦組比較,健脾清化方組腎組織中SOD含量明顯增加(P<0.05),而MDA含量2組間差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,表3)。2.3e,2.4.2e,2.4.2e0.2e3.4和.2e0.213.4假手術(shù)組、模型組、健脾清化方組和氯沙坦組腎組織中AT1蛋白含量依次為1.34±0.05,3.43±0.21,1.43±0.11和1.61±0.14;其中模型組含量明顯高于其他各組(P<0.001),健脾清化方組含量明顯低于氯沙坦組,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,圖1)。2.4各組大鼠腎組織p97p蒸發(fā)表達(dá)比較假手術(shù)組、模型組、健脾清化方組和氯沙坦組腎組織中p47phoxmRNA含量依次為1.00±0.20,2.69±0.39,1.67±0.35和1.87±0.22;與假手術(shù)組比較,各組大鼠腎組織p47phoxmRNA表達(dá)均明顯升高(P<0.05);與模型組比較,健脾清化方組與氯沙坦組大鼠腎組織p47phoxmRNA表達(dá)均明顯降低(P<0.05),氯沙坦組與健脾清化方組p47phoxmRNA表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。3nadph氧化酶抑制劑氧化應(yīng)激是指機(jī)體組織或細(xì)胞內(nèi)氧自由基生成增加或清除能力降低,導(dǎo)致活性氧簇(reactiveoxygenspecies,ROS)家族在體內(nèi)或細(xì)胞內(nèi)蓄積而引起的氧化損傷過(guò)程。研究顯示:CKD患者普遍存在氧化應(yīng)激增強(qiáng),即使是輕度腎功能損害的患者,其氧化應(yīng)激水平較正常人群也有顯著上升,且氧化應(yīng)激水平隨著腎功能惡化而加劇,是影響CKD患者預(yù)后的重要危險(xiǎn)因素。NAD(P)H氧化酶作為產(chǎn)生ROS的主要來(lái)源,參與氧化應(yīng)激損傷并進(jìn)而影響多種疾病的發(fā)生發(fā)展,是目前公認(rèn)的腎疾病中細(xì)胞增殖和基質(zhì)積聚的關(guān)鍵因子。NADPH氧化酶由5個(gè)亞基組成:2個(gè)膜亞基gp91phox和p22phox,兩者構(gòu)成一個(gè)膜復(fù)合體細(xì)胞色素b558;3個(gè)胞漿亞基p47phox,p40phox,p67phox。另外,還有2個(gè)低分子質(zhì)量的三磷酸鳥(niǎo)嘌呤核苷(GTP)結(jié)合蛋白rac1和rac2。NADPH氧化酶系統(tǒng)激活后產(chǎn)生過(guò)量ROS,打破機(jī)體正常氧化/還原動(dòng)態(tài)平衡,造成生物大分子如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸等的氧化損傷,形成氧化應(yīng)激。其中p47phox是NADPH氧化酶發(fā)揮活性的關(guān)鍵亞基。在受到刺激的情況下,NADPH氧化酶通過(guò)其胞質(zhì)成份p47phox的磷酸化與p67phox的移位,最后再與胞膜成份gp91phox和p22v聚集而活化,以NADPH作為電子供體,將氧催化為超氧陰離子。在糖尿病腎病模型中,p47phox表達(dá)增多伴腎氧化應(yīng)激發(fā)展可被NADPH氧化酶抑制劑apocynin所抑制。因此,p47phoxmRNA的表達(dá)水平可作為衡量氧化應(yīng)激程度的一個(gè)指標(biāo)。ATII是NADH/NADPH氧化酶重要的刺激因子,ATII活化細(xì)胞膜上NADPH氧化酶,誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞等產(chǎn)生過(guò)多ROS。在眾多的血管緊張素家族成員中,ATII是最重要的生物活性物質(zhì)。早有研究顯示,在腎大部分切除大鼠實(shí)驗(yàn)中,腎小管上皮細(xì)胞腎素和ATII表達(dá)增加。而在局部腎組織,幾乎所有已知的ATII作用都是通過(guò)AT1受體介導(dǎo)的,AT1受體是當(dāng)下公認(rèn)與腎臟疾病密切相關(guān)的主要靶點(diǎn),ATII與腎細(xì)胞膜上的AT1結(jié)合后,可通過(guò)血液動(dòng)力學(xué)依賴和非血液動(dòng)力學(xué)依賴兩種途徑造成腎臟損害,既可通過(guò)增加腎小球毛細(xì)血管內(nèi)壓引起腎臟的損害,也可通過(guò)刺激腎臟細(xì)胞分泌轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子?(transforminggrowthfactorbeta,TGF-β)等各種生長(zhǎng)、細(xì)胞因子,直接造成腎損害。最新的研究顯示,ATII通過(guò)AT1的介導(dǎo)引起了NADPH亞型Nox4的活化,導(dǎo)致腎局部的DNA損傷。ATII受體拮抗劑替米沙坦可通過(guò)抑制NADPH氧化酶減輕單側(cè)輸尿管梗阻(UUO)模型大鼠腎纖維化。本次實(shí)驗(yàn)中,與模型組相較,氯沙坦組大鼠AT1蛋白表達(dá)與p47phoxmRNA表達(dá)均有顯著下調(diào),SCr、血清BUN與模型組比較明顯下降,表明ATII/NADPH氧化應(yīng)激通路的激活可能是加速腎纖維化的重要途徑,而ATII受體拮抗劑能有效抑制此通路的表達(dá),從而延緩纖維化進(jìn)程,與文獻(xiàn)報(bào)道一致。慢性腎衰竭病程冗長(zhǎng),病機(jī)錯(cuò)綜復(fù)雜,屬本虛標(biāo)實(shí),虛實(shí)夾雜之癥。正虛又有氣、血、陰、陽(yáng)之不同;邪實(shí)則以濕濁熱毒、瘀血為著。越來(lái)越多的臨床資料表明,濕熱與慢性腎衰竭竭的發(fā)生、發(fā)展、治療和預(yù)后有著密切的關(guān)系。朱辟疆等選擇非透析的慢性腎衰竭(chronicrenalfailure,CRF)患者69例,探討CRF微炎癥狀態(tài)與中醫(yī)證型的關(guān)系,結(jié)果顯示夾濕濁或夾濕熱證者微炎癥狀態(tài)最明顯,認(rèn)為微炎癥狀態(tài)程度可作為濕濁證及濕熱證的重要辨證參考。而氧化應(yīng)激作為強(qiáng)氧化劑和抗氧化劑的平衡破壞導(dǎo)致的潛在傷害,通過(guò)各種途徑激活血液中的中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞,活化補(bǔ)體系統(tǒng),產(chǎn)生大量的炎癥細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素-1(IL-1)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)及腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等,是慢性腎衰竭微炎癥狀態(tài)的重要來(lái)源。由此推測(cè),氧化應(yīng)激損傷的有效抑制與慢性腎衰竭患者濕熱狀態(tài)的改善密切相關(guān),進(jìn)而對(duì)延緩腎衰竭纖維化進(jìn)程產(chǎn)生重要作用。故而本次研究試圖從濕熱證與氧化應(yīng)激相關(guān)性的角度進(jìn)行探討。根據(jù)李東垣脾胃學(xué)說(shuō)中“火與元?dú)獠粌闪?一勝則一負(fù),脾胃氣虛則下流于腎,陰火得以乘土位”的主要學(xué)術(shù)理論創(chuàng)制的健脾清化方,集清燥、淡滲、和中為一體,具有益氣和中、清熱化濕之功效,在前期的臨床研究工作中,發(fā)現(xiàn)能較好的降低SCr和血清BUN。本次研究發(fā)現(xiàn):與假手術(shù)組比較,模型組大鼠MDA含量明顯上升,SOD含量顯著下降,存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,說(shuō)明5/6腎切除大鼠模型中存在明顯的氧化激活狀態(tài)。健脾清化方給藥后,大鼠SCr、血清BUN較模型組降低顯著,腎組織MDA含量亦明顯降低,SOD含量顯著上升,提示健脾清化方改善腎功能可能與有效的清除氧自由基及減少氧自由基的合成相關(guān)。實(shí)驗(yàn)中同