1T/GDSMMXXXx-2022斑蘭葉種苗組織培養(yǎng)技術(shù)規(guī)程本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了斑蘭葉種苗生產(chǎn)過程中的術(shù)語和定義、培養(yǎng)基制備、斑蘭葉組培苗生產(chǎn)等方面的技術(shù)規(guī)程。本標(biāo)準(zhǔn)適用于斑蘭葉組織培養(yǎng)繁殖種苗。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。DB15/T1939—2020文冠果組織培養(yǎng)育苗技術(shù)規(guī)程NY/T391綠色食品產(chǎn)地環(huán)境質(zhì)量3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1外植體explant植物組織培養(yǎng)中作為離體培養(yǎng)材料的器官或組織的片段。外植體通常選擇生長健壯的無病蟲的植株上的正常器官或組織。3.2接種inoculation在無菌條件下將表面滅菌后的外植體或繼代、生根組培材料接入培養(yǎng)基的過程。4培養(yǎng)基配制4.1培養(yǎng)基配方MS培養(yǎng)基：具體成分見附錄A中的表A.1。制備用于不定芽誘導(dǎo)的培養(yǎng)基，配方為：在所述MS培養(yǎng)基上添加6-芐氨基嘌呤（6-BA）和萘乙酸（NAA）；在不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中6-芐氨基嘌呤（6-BA）的濃度為1.0mg/L，萘乙酸（NAA）的濃度為0.2mg/L。制備用于繼代增殖的培養(yǎng)基，配方為：在所述MS培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加6-芐氨基嘌呤（6-BA）和萘乙酸（NAA），在繼代增殖培養(yǎng)基中6-芐氨基嘌呤（6-BA）的濃度為1-3.0mg/L，萘乙酸（NAA）2T/GDSMMXXXx-2022的濃度為0.2mg/L。制備用于無菌生根的培養(yǎng)基，配方為：在所述MS培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加吲哚丁酸（IBA）和萘乙酸（NAA在生根培養(yǎng)基中吲哚丁酸（IBA）的濃度為0.2mg/L，萘乙酸（NAA）的濃度為4.1培養(yǎng)基母液及培養(yǎng)基配制按照DB15/T1939—2020執(zhí)行。4.2環(huán)境與器具消毒滅菌按照DB15/T1939—2020執(zhí)行。5組織培養(yǎng)技術(shù)5.1外植體選取生長健康的斑蘭葉嫩莖作為外植體，用中性洗滌劑洗滌外植體，以去除表面的污垢，然后去除多余的葉片，干凈紙巾吸干表面水分備用。5.2外植體消毒在超凈工作臺上，先用70%酒精浸泡30s，再用無菌水沖洗3次，每次3min。立即轉(zhuǎn)入0.1%的升汞溶液中消毒8-12min，最后用無菌水洗滌3-5次，每次5min，用無菌紙巾吸干水份，得到消毒外植體。5.3不定芽誘導(dǎo)在超凈工作臺內(nèi)，將帶芽莖段接種于用于不定芽誘導(dǎo)的培養(yǎng)基；每瓶接1個外植體，分布均勻，封好瓶口后，注明品種代號、接種人員及日期等，放至培養(yǎng)室培養(yǎng)，誘導(dǎo)培養(yǎng)18-22d，得到斑蘭葉不定誘導(dǎo)培養(yǎng)條件如下：溫度為26±3℃,濕度為80-90%，光照時間為14h/d，光照強度為800-12001x。5.4繼代增殖將不定芽誘切除葉片，接入繼代培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)室培養(yǎng)，繼代培養(yǎng)20-25d，得到斑蘭葉叢芽。接種數(shù)量根據(jù)培養(yǎng)容器的大小決定，要求材料擺布均勻，間距1.0cm-2.0cm。繼代增殖培養(yǎng)條件如下：溫度為26±3℃,濕度為50-65%，光照時間為14h/d，光照強度為800-5.5無菌生根當(dāng)繼代增殖培養(yǎng)的斑蘭葉無菌苗生長到3.0cm-5.0cm時，進行切繁，并保持每株均有一個不定芽，接入用于無菌生根的培養(yǎng)基中進行生根培養(yǎng)15-20d，得到斑蘭葉幼苗。接種數(shù)量根據(jù)培養(yǎng)容器的大小決定，要求材料擺布均勻，間距1.0cm-2.0cm。無菌苗在培養(yǎng)基中的插入深度為5mm-8mm，保持壯苗直立。3T/GDSMMXXXx-20225.6煉苗幼苗生長至根長0.3cm、苗高5cm后，將培養(yǎng)瓶瓶蓋打開，室內(nèi)煉苗培養(yǎng)5-7d，5.7假植然后洗凈根部培養(yǎng)基，移入采用64孔的穴盤，基質(zhì)為泥炭土與園土，比例為5：1，澆定根水1-2次，保持葉面濕度。保持棚內(nèi)溫度25-30℃,澆水遵循見干見濕原則。4T/GDSMMXXXx-2022（資料性附錄）表A.1MS培養(yǎng)基混合母液配制表母液名稱編號化試名稱mg/L擴大倍數(shù)擴大后稱mg母液定容體積mL配置培養(yǎng)基吸取量mL/L大量元素ANH4NO3406600025KNO34076000MgSO4·7H2O3704014800BCaCl2·2H2O44044000CKH2PO417000鐵鹽DFeSO4·7H2O27.82780Na2EDTA·2H2O37.23720微量元素EMnSO4·4H2O22.32230ZnSO4·7H2O8.6860H3BO36.2620有機成分FKI0.83Na2