基于坐骨神經(jīng)切斷術(shù)建立廢用性骨質(zhì)疏松模型

骨少性稀釋是指由于機械應(yīng)力對骨的影響而導(dǎo)致局部或整體骨缺損和骨重減輕的局部或整體骨輕松。近年來,國內(nèi)外有關(guān)本病的病因、發(fā)病機制和防范措施已有較深入的研究,以大鼠為動物模型的研究較多,但對失神經(jīng)造模后發(fā)生廢用性骨質(zhì)疏松的時間段并無一致認(rèn)識。本研究旨在探討模型大鼠發(fā)生廢用性骨質(zhì)疏松的最佳時間段。材料和方法一、u3000大鼠隨機坐骨神經(jīng)損傷術(shù)后檢測時間3個月齡SD大鼠78只,體重(283.5±41.7)g,雌雄不限,由江蘇大學(xué)實驗動物中心提供。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,72只大鼠隨機均分為假手術(shù)組(S組,手術(shù)顯露坐骨神經(jīng)后即縫合切口)和模型組(M組,行左后肢坐骨神經(jīng)切斷術(shù));每組根據(jù)術(shù)后檢測時間(1、2、4、6、8、12周)分為6個亞組,每組6只。另6只作為空白對照組(BC組)。精飼料喂養(yǎng)3個月,自由飲用自來水,切口保持干潔,定期碘伏消毒。二、血清骨鈣素、堿性磷酸酶及尿羥脯氨酸與尿胱氨酸配比檢測M組和S組分別在術(shù)后第1、2、4、6、8、12周各取6只大鼠收集晨尿。處死解剖后心臟穿刺抽取血液0.5-1ml,注入離心管,在室溫下靜置2h后,低速(3000r/min)離心,留取血清,置冰箱內(nèi)-20℃冷凍保存。檢測項目:血清骨鈣素(BGP)、堿性磷酸酶(ALP)、抗酒石酸酸性磷酸酶(Strap)及尿羥脯氨酸與尿肌酐比值(HOP/Cr);進行左脛骨近側(cè)干骺段骨組織形態(tài)學(xué)觀察。三、檢測方法1.樣品的測定使用全自動生化分析儀測定尿Cr指標(biāo),尿HOP用對二甲氨苯甲醛法測定,BGP用放射免疫計數(shù)器進行標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣品的測定,Strap用免疫酶聯(lián)法,ALP用酶聯(lián)免疫法。2.遠(yuǎn)側(cè)干端骨組織形態(tài)觀察取各組左脛骨近側(cè)干骺段,甲醛固定,EDTA液脫鈣,冠狀對剖,酒精順濃度梯度脫水,組織浸蠟,石蠟包埋,5μm切片,HE染色和Masson染色,鏡下觀察股骨遠(yuǎn)側(cè)干骺端骨組織形態(tài)改變。四、統(tǒng)計學(xué)處理方法采用SPSS軟件包統(tǒng)計分析。呈正態(tài)分布的計量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉx±s)表示,多組間比較采用單因素方差分析,兩組間比較采用t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。術(shù)后正常攝食和骨髓內(nèi)固定試驗中無動物意外死亡,觀察各時間段內(nèi)大鼠體重增長基本正常。部分大鼠手術(shù)切口紅腫,經(jīng)消毒等處理后愈合良好。M組大鼠造模后即出現(xiàn)患肢跛行,至處死時仍不能恢復(fù);但均可以三個肢體行走及正常覓食。S組術(shù)后1-2周即可恢復(fù)四個肢體行走及正常覓食。隨著去神經(jīng)時間的延長,M組BGP和尿HOP/Cr逐漸降低,而ALP和Strap逐漸升高,其4、6、8、12周的水平與1、2周差異明顯(P<0.05),而術(shù)后4、6、8、12周之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。M組骨皮質(zhì)變薄,孔隙增多,骨小梁稀疏、纖細(xì)并有多處斷裂,小梁間吻合減少,骺板下區(qū)空曠,髓腔擴大,破骨細(xì)胞數(shù)增多。Masson染色見隨著廢用時間的延長,新生膠原的量也在減少。(表1)骨組織及彈性質(zhì)細(xì)胞的變化廢用性骨質(zhì)疏松是由于各種原因?qū)е轮w制動、全身不活動或者失重以后,體內(nèi)骨形成和骨吸收的平衡被打亂,成骨細(xì)胞介導(dǎo)的新骨形成減低,而破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收增強,所導(dǎo)致的局部性或者全身性骨量減低和骨的力學(xué)性能的顯著降低,患者的骨折發(fā)生率顯著增高。骨形成的指標(biāo):血清ALP、BGP;骨吸收的指標(biāo):Strap、尿HOP/Cr。當(dāng)骨形成與骨吸收偶聯(lián)時,BGP是反映骨轉(zhuǎn)換的指標(biāo);而當(dāng)骨形成與骨吸收解偶聯(lián)時,BGP是反映骨形成的特異指標(biāo),BGP作為直接反映骨形成的特異性指標(biāo),可用來監(jiān)測骨質(zhì)疏松和判斷其他代謝性骨病治療效果。血清ALP包括總堿性磷酸酶和骨堿性磷酸酶,在沒有肝臟疾病的情況下,血中ALP其含量的變化大致反映骨的代謝變化的程度,但對與骨組織而言缺乏特異性。骨源性酸性磷酸酶能抵抗酒石酸的抑制,故而稱之為Strap,血液Strap主要來源于骨吸收過程中破骨細(xì)胞的釋放,Strap的活性與骨吸收狀況相平行。尿HOP主要反映骨組織膠原代謝的變化;在沒有明顯的皮膚疾病和其他結(jié)締組織疾病時,尿HOP在很大程度上反映骨代謝的改變。研究表明,尿HOP/Cr比值同骨吸收呈顯著正相關(guān),可以將尿羥脯氨酸和肌酐比值的水平作為衡量骨有機質(zhì)吸收的重要生化指標(biāo)。本研究中,造模術(shù)后各時間段模型組直接反映骨形成的特異性指標(biāo)BGP顯著性降低,反映骨內(nèi)膠元代謝變化的指標(biāo)HOP/Cr顯著性增加,血清ALP顯著升高,一定程度上揭示骨轉(zhuǎn)換率及骨形成明顯增加;血清Strap顯著升高,標(biāo)志著骨吸收增加。骨組織形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)模型組骨皮質(zhì)與假手術(shù)組相比較薄,孔隙增多,骨小梁稀疏、纖細(xì)并有多處斷裂,小梁間吻合減少,骺板下區(qū)空曠,髓腔擴大,破骨細(xì)胞數(shù)增多,新生膠原的量減少,且隨著觀察時間延長,表現(xiàn)越明顯。這些指標(biāo)的改變表明廢用性骨質(zhì)疏松的大鼠模型建立成功。目前復(fù)制廢用性骨質(zhì)疏松動物模型所采用的動物和方法較多,其中以大白鼠為最常選用,Baron等認(rèn)為,12周左右的大鼠其二級松質(zhì)骨的重建酷似人類骨骼,因此以研究人類為目的而以大鼠為實驗?zāi)Ｐ褪强尚械?。與其他模型比較,失神經(jīng)引起的局部骨質(zhì)疏松在本質(zhì)上更接近于臨床上所見到的廢用性骨質(zhì)疏松。但查閱文獻發(fā)現(xiàn),采用大鼠失神經(jīng)造模后發(fā)生廢用性骨質(zhì)疏松的時間段并不一致,以及通過此造模方法觀察廢用性骨質(zhì)疏松最佳時間段未見相關(guān)報道。Zeng等報道失神經(jīng)后骨形成下降,骨吸收增加,骨丟失在術(shù)后10-42d達(dá)高峰,并在X線片上有反映。唐學(xué)陽等將4周齡SD雄性大鼠通過腿-尾固定法制動2周和4周后發(fā)現(xiàn)股骨濕重、灰重、股骨和脛骨骨密度均顯著低于對照組,脛骨近側(cè)干骺端骨組織成骨細(xì)胞胞漿和核膜維生素D表達(dá),制動后表達(dá)增強。大鼠后肢制動2周后,右后肢脛骨近側(cè)干骺端的骨小梁面積約為同齡對照組的68.2%,骨小梁周長約為同齡對照組的76.8%;在制動4周后,右后肢脛骨近側(cè)干骺端的骨小梁面積僅為同齡對照組的28.8%,骨小梁周長則約為同齡對照組的39.4%,與制動2周時相比,隨著制動時間的延長,兩者均有明顯的下降。本研究顯示,M組血BGP術(shù)后1周與其他時間段、術(shù)后2周與其他時間段之間的