廣州管圓線蟲在不同螺源中的發(fā)育情況及對(duì)balbc小鼠和昆明鼠的毒力比較

廣州管蟲病是一種由人類感染的寄生蟲。廣州管蟲是其病原。廣州管圓線蟲是1933年由我國(guó)學(xué)者陳心陶在廣州的家鼠肺部發(fā)現(xiàn)并命名的,屬圓線蟲目、后圓線蟲科、后圓線蟲亞科、管圓線蟲屬。成蟲寄生在肺動(dòng)脈血管內(nèi),幼蟲侵入中樞神經(jīng)系統(tǒng)可致嗜酸粒細(xì)胞增多性腦膜腦炎。廣州管圓線蟲的中間宿主主要為螺類和蛞蝓(俗名鼻涕蟲),螺類常見(jiàn)的有褐云瑪瑙螺、福壽螺。終宿主主要為嚙齒動(dòng)物尤其是鼠類,以褐家鼠和黑家鼠較多見(jiàn),此外還有白腹巨鼠、黃毛鼠和屋頂鼠等。近年來(lái),由于廣州管圓線蟲病的中間宿主褐云瑪瑙螺和福壽螺的大量養(yǎng)殖及食用,導(dǎo)致廣州管圓線蟲病的播散,但尚無(wú)文獻(xiàn)比較兩種螺內(nèi)廣州管圓線蟲Ⅲ期幼蟲的毒力是否存在差異。BALB/c及昆明(KM)小鼠為常用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,均可感染廣州管圓線蟲,但哪種小鼠對(duì)廣州管圓線蟲更易感少有報(bào)道。為尋找適合于實(shí)驗(yàn)室感染使用的螺及小鼠,更好地為有關(guān)廣州管圓線蟲的系列研究提供實(shí)驗(yàn)材料,本研究比較了兩種小鼠及兩種常見(jiàn)中間宿主螺對(duì)廣州管圓線蟲的感染特征。1材料和方法1.1小鼠、大鼠、sd大鼠實(shí)驗(yàn)動(dòng)物12只6周齡(體重16~20g)雌性BALB/c小鼠,32只6周齡(體重26~30g)雌性昆明小鼠及3只體重250g左右雌性SD大鼠均購(gòu)自中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。SD大鼠用于廣州管圓線蟲的實(shí)驗(yàn)室人工保種。1.2實(shí)驗(yàn)螺釘從本實(shí)驗(yàn)室養(yǎng)螺池中隨機(jī)抽取20只重16~26g的褐云瑪瑙螺和20只重8~12g福壽螺作為本次實(shí)驗(yàn)感染用螺。1.3小鼠感染期幼蟲的方法及分組從本實(shí)驗(yàn)室感染螺中分離廣州管圓線蟲Ⅲ期幼蟲,每只SD大鼠感染50條,2個(gè)月后取糞便檢查,當(dāng)糞便中能檢測(cè)到Ⅰ期幼蟲時(shí),取大鼠糞便分別喂食褐云瑪瑙螺與福壽螺(10g/d),連續(xù)7d。1個(gè)月后,將上述兩組螺去殼、剁碎、消化(每1000ml消化液中含胰蛋白酶2g、鹽酸7ml、蒸餾水993ml,37℃消化2h)、過(guò)濾、沉渣水洗2次后,10倍光鏡下檢查。Ⅲ期幼蟲大小為(425~524)μm×(23~34)μm,Ⅱ期較之要小。按常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法,經(jīng)灌胃每小鼠感染Ⅲ期幼蟲30條。12只BALB/c小鼠和32只昆明小鼠隨機(jī)分組及處理如下:A組12只昆明小鼠,感染幼蟲取于福壽螺;B組為BALB/c小鼠,感染幼蟲來(lái)自于褐云瑪瑙螺;C組12只昆明小鼠用取自于褐云瑪瑙螺的幼蟲灌胃;D組8只昆明小鼠作為無(wú)感染對(duì)照組。1.4測(cè)量大鼠體重和死亡每天檢查小鼠,記錄小鼠死亡時(shí)間及數(shù)量。記錄實(shí)驗(yàn)小鼠感染前及解剖前(感染后23d)的體重,觀察每只小鼠體重變化(不包括死亡小鼠)。1.5總蛋白和總ph的制備用乙醚麻醉處死小鼠后,斷頸,以鑷子逐漸剝離顱骨,將小鼠腦組織置于35mm玻璃平皿中,用1ml中性PBS沖洗腦室,所得液體收集于EP管中。5000r/min離心10min,取500μl上清在595nm波長(zhǎng)光下用HITACHIU1100(日本)分光光度計(jì)作總蛋白檢測(cè)。10μl腦脊液上清加入等量的SDS上樣緩沖液中,在8%含1%明膠的聚丙烯酰胺凝膠中電泳,分離膠為4%普通聚丙烯酰胺凝膠,120V1h電泳后,將膠取下。2.5%TritonX100洗滌30min2次后,雙蒸水洗滌2次,用pH7.8含1mmol/LCaCl2的0.1Mtris-HCl緩沖液,37℃孵育24h?？捡R斯亮藍(lán)染色1h,用含40%甲醇及10%乙酸的脫色液脫色約30min,水洗后掃描,根據(jù)條帶大小判斷基質(zhì)金屬蛋白酶9(mmp-9)的活性。1.6大鼠腦中的昆蟲記錄將每個(gè)處死小鼠的顱腦組織浸泡于10ml中性PBS中,讓幼蟲自動(dòng)溢出,10倍解剖鏡下數(shù)活蟲。1.7切片、脫蠟、去蠟小鼠腦組織在4%多聚甲醛中浸泡固定24h后,50%、75%及100%乙醇脫水,二甲苯透明,55℃石蠟包埋24h,4μm厚度組織切片。每塊切片65℃5min加熱除去蠟塊,二甲苯漂洗脫蠟5min3次,隨后在100%、95%及75%乙醇中水化各5min,最后用三蒸水洗滌。伊紅美藍(lán)染色,光鏡下觀察病理改變。1.8統(tǒng)計(jì)分析死亡率、感染率及幼蟲比率采用卡方檢驗(yàn),其他指標(biāo)采用多重均數(shù)的秩和檢驗(yàn)法,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1表1表2表2存活褐云瑪瑙螺及福壽螺均找到幼蟲(表1)。兩種螺內(nèi)Ⅲ期幼蟲的比率及螺的死亡率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但褐云瑪瑙螺的幼蟲數(shù)高于福壽螺(表1)。2.2感染小鼠血清學(xué)指標(biāo)檢測(cè)33.33%的BALB/c小鼠感染廣州管圓線蟲后出現(xiàn)死亡,但昆明鼠全部存活。感染小鼠均有不同程度的腦脊液蛋白增高(表2),腦內(nèi)查到Ⅳ期或Ⅴ期幼蟲。不同感染來(lái)源的兩組昆明小鼠相比,這些指標(biāo)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),而BALB/c小鼠腦內(nèi)蟲體數(shù)及腦脊液中蛋白量高于感染昆明小鼠(P<0.05)。2.3大鼠mgp-9活性試驗(yàn)的結(jié)果感染小鼠均出現(xiàn)mmp-9活性增強(qiáng),但以BALB/c組小鼠最明顯(圖1)。2.4大鼠的體重改變感染BALB/c小鼠體重下降;感染昆明鼠體重上升,且感染昆明鼠體重變化與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2)。2.5大鼠腦組織病理學(xué)的結(jié)果組織病理學(xué)檢查可發(fā)現(xiàn)感染小鼠腦部特別是腦膜出現(xiàn)炎癥反應(yīng)、嗜酸粒細(xì)胞侵入甚至出現(xiàn)紅細(xì)胞(圖3),但以BALB/c小鼠最為嚴(yán)重。3不同大小褐云瑪瑙螺感染廣州管圓線蟲的環(huán)保意義福壽螺及褐云瑪瑙螺為實(shí)驗(yàn)室常用的廣州管圓線蟲感染用螺。有報(bào)道稱東方圓田螺及銅銹環(huán)棱螺也可感染,但東方圓田螺蟲密度低于福壽螺及褐云瑪瑙螺,而褐云瑪瑙螺的相容性最好。我們的實(shí)驗(yàn)也證明福壽螺及褐云瑪瑙螺均為易感螺;經(jīng)比較來(lái)源于不同螺類的蟲株其致病力無(wú)顯著性差異,蟲體的發(fā)育也無(wú)差異。廣州管圓線蟲存在不同的地理株,但來(lái)自于不同宿主的蟲株暫未發(fā)現(xiàn)基因差異(結(jié)果未公布),所以宿主對(duì)蟲株的影響可能不太明顯。相對(duì)而言,每只褐云瑪瑙螺可攜帶較單只福壽螺更多的幼蟲,這可能與褐云瑪瑙螺體重及體積更大有關(guān)。福壽螺繁殖快,成熟期短,但需頻繁換水,這不僅增加了水的消耗,而且螺卵及幼螺也可能隨水流出,導(dǎo)致環(huán)境污染。而褐云瑪瑙螺為陸生螺,只要注意飼喂,從環(huán)保角度看,褐云瑪瑙螺較福壽螺更適合于實(shí)驗(yàn)室使用。mmp-9活性、組織病理變化、腦內(nèi)蟲體數(shù)、腦脊液總蛋白含量等指標(biāo)常用于衡量廣州管圓線蟲的病變程度;體重減輕及死亡率是衡量感染動(dòng)物病變程度的公認(rèn)指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)表明,來(lái)源于福壽螺和褐云瑪瑙螺的廣州管圓線蟲Ⅲ期幼蟲毒力無(wú)明顯差異,兩組感染昆明小鼠mmp-9活性、死亡率、腦內(nèi)蟲體數(shù)、腦脊液總蛋白含量、體重變化與腦組織病理變化均未顯示出差異。不同的寄生蟲有其合適的宿主,敏感的動(dòng)物模型對(duì)人體寄生蟲的治療、預(yù)防與診斷的研究都是非常重要的。小鼠是廣州管園線蟲常見(jiàn)的動(dòng)物模型,從我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看,昆明小鼠對(duì)廣州管圓線蟲的感染不如BALB/c小鼠敏感,BALB/c小鼠各項(xiàng)病理指標(biāo)較昆明鼠更明顯,因而與昆明鼠比較BALB/c小鼠更適合于做廣州管圓線蟲的感染模型。有文章報(bào)道,家兔及豚鼠也為廣州管圓線蟲的非適宜宿主,但同期的小樣本實(shí)驗(yàn)中感染的家兔及豚鼠均未在腦內(nèi)檢獲幼蟲,家兔及豚鼠是否