香果健消片中橙皮苷的鑒別和含量測(cè)定

香果健消片是將蜘蛛、木香、草果等醫(yī)療材料提取而成的中藥制劑。它對(duì)健胃和消食也很有效。用于消化不良、腫脹、胸悶、腹脹、胸悶?，F(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》中藥成方制劑,該質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中,只用香草醛進(jìn)行顯色鑒別,無專屬性較強(qiáng)的薄層色譜鑒別和含量測(cè)定方法。為了保證本品的用藥安全,更好地控制藥品質(zhì)量,本實(shí)驗(yàn)對(duì)方中主藥蜘蛛香進(jìn)行薄層色譜法(TLC)鑒別,并采用高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定其主要化學(xué)成分橙皮苷的含量。1設(shè)備和材料1.1高效液相色譜法Agilent1200高效液相色譜儀(包括G1311A四元泵、G1314B可變波長(zhǎng)、G1316A柱溫箱、G1329A自動(dòng)控溫進(jìn)樣器、G1322A真空脫氣機(jī));AgilentXBP-C18(4.6×250mm,5μm)分析柱;電子分析天平(瑞士梅特勒AL204-IC);薄層色譜成像儀(武漢藥科新技術(shù)開發(fā)有限公司YOKO-ZS);超純水機(jī)(臺(tái)灣艾柯純水設(shè)備廠KL-UP-UV-20);超聲波清洗器(寧波新芝生物科技股份有限公司SB5200DT)。1.2生物化學(xué)成分對(duì)照品香果健消片(云南云河藥業(yè)有限公司生產(chǎn),批號(hào):090603,090706,090802,081201);橙皮苷對(duì)照品(批號(hào):110721-200613,中國(guó)藥品生物制品鑒定所提供);硅膠G(青島海洋化工有限公司生產(chǎn));甲醇為色譜純(美國(guó)Fisher公司);水為超純水;其它試劑均為分析純。2識(shí)別標(biāo)記2.1對(duì)照品貯備液的制備精密稱取橙皮苷對(duì)照品5.050mg,置10mL量瓶中,加甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,制成0.505mg/mL的對(duì)照品貯備液。精密移出上述溶液400μL,用甲醇稀釋至1.0mL,即得對(duì)照品溶液(含橙皮苷0.202mg/mL)。2.2供試品溶液的制備稱取不同批號(hào)(090603、090706、081201)各10片,去糖衣,精密稱定,研細(xì),各取約1.0g,精密稱定,加入20mL甲醇,稱定重量,25℃超聲提取30min,放冷,濾過,濾液置水浴上揮干,殘?jiān)骷尤?.0mL甲醇,溶解,即得供試品溶液1,2,3(批號(hào)分別為090603、090706、081201)。2.3由蜘蛛香生產(chǎn)的藥物按處方制備蜘蛛香對(duì)照藥材,再按“2.2”項(xiàng)制備,即得蜘蛛香對(duì)照藥材溶液。2.4陰性對(duì)照溶液的制備按處方制備缺蜘蛛香的陰性對(duì)照品,再按“2.2”項(xiàng)制備,即得陰性對(duì)照品溶液。2.5苯甲酰胺鹽的合成參照TLC試驗(yàn),用毛細(xì)吸管吸取上述供試品、對(duì)照品、對(duì)照藥材、陰性對(duì)照溶液,分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上,以乙酸乙酯-甲醇-水(100∶17∶15)的上層溶液為展開劑,進(jìn)行一次展開,展至約6cm,取出,晾干。再以甲苯-乙酸乙酯-甲酸-水(20∶10∶1∶3)為展開劑,進(jìn)行二次展開,展開至16cm,取出,晾干,噴以3%AlCl3溶液,在110℃下加熱至斑點(diǎn)顯色清晰,置紫外光燈(365nm)下檢視。供試品色譜中,在與對(duì)照品、對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上,分別顯相同顏色的熒光斑點(diǎn),陰性對(duì)照無相應(yīng)的熒光斑點(diǎn)。見圖1。3重量測(cè)定3.1流動(dòng)相冰醋酸色譜柱:AgilentXBP-C18分析柱(4.6×250mm,5μm);流動(dòng)相:甲醇-5%冰醋酸溶液(35∶65);檢測(cè)波長(zhǎng)283nm;柱溫35℃;流速1.0mL/min。理論塔板數(shù)按橙皮苷峰計(jì)算應(yīng)不低于2500。3.2試驗(yàn)溶液的制備3.3陰性對(duì)照溶液的制備取缺蜘蛛香的陰性對(duì)照樣品0.5g,按“3.2”項(xiàng)供試品溶液的制備方法制備,即得。3.4色譜干擾試驗(yàn)精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液各5μL,分別注入液相色譜儀,結(jié)果供試品色譜中呈現(xiàn)與對(duì)照品保留時(shí)間相同的色譜峰,陰性對(duì)照品在橙皮苷對(duì)照品相同保留時(shí)間處未顯色譜峰,故認(rèn)為無干擾。見圖2。3.5橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)曲線按“3.1”項(xiàng)色譜條件,取0.202mg/mL的對(duì)照品溶液,分別以1,2,5,8,15,20μL進(jìn)樣測(cè)定,以橙皮苷的峰面積峰值為縱坐標(biāo),進(jìn)樣量為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸方程為:y=2036.6X+10.554(r=0.9999)。結(jié)果表明,橙皮苷在0.202~4.040μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。3.6精密度測(cè)試按“3.1”項(xiàng)色譜條件,取0.202mg/mL的對(duì)照品溶液連續(xù)6次進(jìn)樣,峰面積的RSD為0.83%。結(jié)果表明,儀器精密度良好。3.7峰面積按“3.1”項(xiàng)色譜條件,按“3.2”項(xiàng)制備供試品溶液,在0,2,4,6,8,10,12h各進(jìn)樣1次,測(cè)定供試品溶液中橙皮苷峰面積值,所得橙皮苷的峰面積RSD為2.75%。結(jié)果表明:供試品溶液中橙皮苷12h內(nèi)穩(wěn)定。3.8試驗(yàn)品溶液制備取同一批號(hào)(090603)樣品6份,按“3.2”項(xiàng)制備各供試品溶液,并按“3.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行測(cè)定,橙皮苷的含量為0.85mg/片,RSD為2.43%。3.9加樣回收率試驗(yàn)取已知含量的同一批號(hào)(090603)樣品6份,每份約0.45g,精密稱定,各加入橙皮苷貯備溶液(0.505mg/mL)1mL,按“3.2”項(xiàng)供試品溶液制備方法制備,按“3.1”項(xiàng)色譜條件測(cè)定,計(jì)算回收率。見表1。3.10樣品含量的測(cè)量取4個(gè)不同批號(hào)的藥品,按“3.2”項(xiàng)供試品溶液制備方法制備,按“3.1”項(xiàng)色譜條件測(cè)定,計(jì)算。結(jié)果見表2。4色譜條件篩選橙皮苷在甲醇中易溶解,故在薄層色譜鑒別、HPLC測(cè)定橙皮苷時(shí)選用甲醇作溶劑。原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中“鑒別”屬化學(xué)鑒別,由于其專屬性不強(qiáng),故本實(shí)驗(yàn)采用TLC對(duì)香果健消片中蜘蛛香主要化學(xué)成分橙皮苷進(jìn)行了薄層鑒別。對(duì)薄層條件進(jìn)行優(yōu)化:考察了不同比例的展開劑(乙酸乙酯-甲醇-水、甲苯-乙酸乙酯-甲酸-水)系統(tǒng),結(jié)果采用乙酸乙酯-甲醇-水(100∶17∶15)、甲苯-乙酸乙酯-甲酸-水(20∶10∶1∶3)為展開劑。供試品色譜中,在與對(duì)照品相應(yīng)的位置上顯相同顏色的熒光斑點(diǎn),有5個(gè)斑點(diǎn)與對(duì)照藥材相對(duì)應(yīng),陰性對(duì)照無相應(yīng)的熒光斑點(diǎn)。試驗(yàn)結(jié)果表明陰性對(duì)照溶液對(duì)供試品均無干擾,專屬性強(qiáng)、斑點(diǎn)清晰,特征斑點(diǎn)分離效果良好,斑點(diǎn)無拖尾現(xiàn)象,故此方法可用作香果健消片中橙皮苷的鑒別。對(duì)制劑中橙皮苷進(jìn)行含量測(cè)定研究,為了在短時(shí)間內(nèi)獲得好的分離效果,對(duì)色譜條件進(jìn)行了優(yōu)化:首先,考察了不同組成和比例的流動(dòng)相(乙腈-水、甲醇-水)系統(tǒng),酸主要比較了冰醋酸和磷酸。結(jié)果乙腈-水系統(tǒng)分離效果不如甲醇-水系統(tǒng),且在甲醇-水系統(tǒng)中加入5%的冰醋酸可提高分離效果。綜合考慮各因素后確定采用甲醇-5%冰醋酸溶液(35∶65)為流動(dòng)相進(jìn)行洗脫。其次,考察了不同的波長(zhǎng)(280、283nm)、不同的柱溫(25、30、35℃),最后確定波長(zhǎng)為283nm、柱溫為35℃。在上述條件下,