第十二章轉(zhuǎn)基因動(dòng)物轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是動(dòng)物基因工程在醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究中的突出成果。近十年來(lái)，為分子遺傳學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)、腫瘤研究及優(yōu)良經(jīng)濟(jì)動(dòng)物的開(kāi)發(fā)研究等多方面做出了很大的貢獻(xiàn)。（一）轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的概念

轉(zhuǎn)基因動(dòng)物（transgenicanimal）是指以實(shí)驗(yàn)方法導(dǎo)入的外源基因在其染色體基因組內(nèi)穩(wěn)定整合并能遺傳給后代的一類(lèi)動(dòng)物。外源基因隨細(xì)胞分裂分配到所有子細(xì)胞中并遺傳給后代，這種動(dòng)物叫轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。嚴(yán)格說(shuō)，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物有別于嵌合體。嵌合體動(dòng)物（chimericanimal）：只有部分組織細(xì)胞的基因組中整合有外源基因。

逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法、胚胎干細(xì)胞介導(dǎo)法制備的動(dòng)物第一代均為嵌合體。雄原核顯微注射法制備的動(dòng)物第一代中1-10%為嵌合體（延遲整合）。Gordon等人首次成功地將含有HSV和SV40DNA片段的重組質(zhì)粒DNA以顯微注射法導(dǎo)入小鼠受精卵的雄原核內(nèi)，得到了帶有這種外源DNA順序TGM。1982年P(guān)almiter等運(yùn)用此法得到的所謂“超級(jí)巨鼠”,曾引起整個(gè)生物學(xué)界的轟動(dòng)。到目前為止，人類(lèi)已獲得轉(zhuǎn)基因魚(yú)、鼠、羊、豬、兔、牛等等大小動(dòng)物。從轉(zhuǎn)基因動(dòng)物所獲得的資料幾乎涉及醫(yī)學(xué)遺傳、腫瘤學(xué)、免疫學(xué)等的基因研究，還涉及生物藥物的研究，基因治療的開(kāi)發(fā)研究等。AfterDolly繼“多莉羊”之后：13歲成年牛轉(zhuǎn)基因無(wú)毛鼠轉(zhuǎn)基因無(wú)毛雞異體動(dòng)物克隆---北山羊黃禹錫學(xué)生克隆成功的阿富汗獵狗在韓國(guó)首都漢城的漢城大學(xué)，世界上首只克隆狗--小獵犬『斯納皮』首次公開(kāi)亮相?？寺⊥迷趶V西大學(xué)誕生

美國(guó)加州的一家公司可為顧客克隆其寵物

二、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)的主要步驟獲取外源目的基因外源目的基因?qū)肷臣?xì)胞或胚胎干細(xì)胞選擇攜帶目的基因的細(xì)胞，選擇體外培養(yǎng)系統(tǒng)和宿主動(dòng)物轉(zhuǎn)基因胚胎的發(fā)育及鑒定篩選所得的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物三、

轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的技術(shù)路線(xiàn)

經(jīng)典的技術(shù)路線(xiàn)

目的基因

顯微注射

已交配的取出

移植受體動(dòng)物妊娠

供體動(dòng)物受精卵輸卵管轉(zhuǎn)基因動(dòng)物

缺點(diǎn)：注入目的基因的命中率低，目的基因的整合率低，受精卵移植的受孕率低。

轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的技術(shù)路線(xiàn)(續(xù))

整合胚胎移植的技術(shù)路線(xiàn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物受體動(dòng)物子宮

目的基因非手術(shù)

胚胎移植

體外受精

體外培養(yǎng)多細(xì)胞胚胎

檢測(cè)整合外源基因

卵子受精卵或囊胚的胚胎

精子

優(yōu)點(diǎn)：受精卵的成活率高達(dá)90％以上，外源基因整合率高，提高受孕率。

轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的技術(shù)路線(xiàn)（續(xù)）核移植（克?。┑募夹g(shù)路線(xiàn)

目的基因轉(zhuǎn)基因動(dòng)物

導(dǎo)入

動(dòng)物胎兒成纖維細(xì)胞妊娠

取核

動(dòng)物去核重組的體外培養(yǎng)囊胚期胚胎移植

卵細(xì)胞受精卵胚胎受體動(dòng)物子宮

特點(diǎn)：體細(xì)胞核移植；核移植前導(dǎo)入目的基因。

轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的技術(shù)路線(xiàn)（續(xù)）整合卵受精的技術(shù)路線(xiàn)：

目的基因轉(zhuǎn)基因動(dòng)物

導(dǎo)入

逆轉(zhuǎn)錄病毒妊娠

精子

感染

體外受精

胚胎移植

卵母細(xì)胞成熟卵細(xì)胞囊胚受體動(dòng)物子宮

特點(diǎn)：卵母細(xì)胞導(dǎo)入目的基因后再與精子受精。四轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的制作方法1、受精卵雄原核顯微注射法2、胚胎干細(xì)胞（ES細(xì)胞）法3、逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法4、體細(xì)胞核移植法5、精子載體法6、YAC法1、雄原核顯微注射法以單細(xì)胞受精卵為靶細(xì)胞，利用顯微注射技術(shù)將構(gòu)建好的載體DNA直接注射入受精卵的原核，再將接受注射的受精卵移入假孕母體輸卵管繼續(xù)發(fā)育獲得轉(zhuǎn)基因動(dòng)物個(gè)體。

目前應(yīng)用較廣泛，最早最經(jīng)典的方法。這一方法的實(shí)驗(yàn)程序如下：（1）準(zhǔn)備假孕母鼠（養(yǎng)母）（2）受精卵的準(zhǔn)備（3）基因?qū)耄?）胚胎移植（5）對(duì)幼鼠的鑒定TimingofPre-ImplantationeventsOviductTransfers優(yōu)點(diǎn)：外源DNA大小基本不受限制（1-50kb）；導(dǎo)入過(guò)程直觀(guān)；整合率高缺點(diǎn)：設(shè)備昂貴、環(huán)節(jié)較多對(duì)操作人員有較高的技術(shù)要求低效率（尤其是大家畜）對(duì)卵子傷害大，胚胎存活率低基因整合隨機(jī)性轉(zhuǎn)基因沉默2、胚胎干細(xì)胞（ES細(xì)胞）法ES細(xì)胞是早期胚胎的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)經(jīng)過(guò)體外培養(yǎng)建立起來(lái)的多潛能細(xì)胞系。將攜帶有外源基因的ES細(xì)胞注入到動(dòng)物的早期胚胎內(nèi)，可產(chǎn)生嵌合體及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。它本身是二倍體，能在體外培養(yǎng)，具有高度的全能性，可以形成包括生殖細(xì)胞在內(nèi)的所有組織，并且在不同的培養(yǎng)條件下表現(xiàn)出不同的功能狀態(tài)。在ES細(xì)胞上的基因操作：可以通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄病毒感染、脂質(zhì)體介導(dǎo)、電穿孔、磷酸鈣共沉淀等方法將外源基因?qū)隕S細(xì)胞。因此，借用ES細(xì)胞系可將人們企望的某種不完整的、無(wú)功能基因直接引入到ES細(xì)胞中，通過(guò)細(xì)胞增殖、篩選可得到喪失了某種基因功能的動(dòng)物后代。GeneratingESCellsRetrievalofBlastocystsInjectionofES

cellsintoblastocysts優(yōu)點(diǎn)：外源基因整合情況的可控性高。可預(yù)先在細(xì)胞水平檢測(cè)外源基因的拷貝數(shù)、定位、表達(dá)的水平及插入的穩(wěn)定性。外源基因?qū)隕S細(xì)胞的方法多樣，細(xì)胞鑒定及篩選方便。缺點(diǎn)：ES細(xì)胞系建立及培養(yǎng)困難維持ES細(xì)胞的未分化及多向分化潛能不易所得個(gè)體為嵌合體目前，胚胎干細(xì)胞介導(dǎo)法在小鼠上應(yīng)用比較成熟，在大動(dòng)物上應(yīng)用較晚。五轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的特性整合拷貝數(shù)1-100左右，多拷貝常以首尾相連接的形式存在。整合是隨機(jī)的。整合是穩(wěn)定的，可以傳給子代。外源基因可以在一種組織或多種組織中表達(dá)。少數(shù)外源基因兩側(cè)序列有重排現(xiàn)象?；虮磉_(dá)強(qiáng)弱與拷貝數(shù)無(wú)關(guān)，與“位置效應(yīng)”有關(guān)。六轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的意義轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是在單細(xì)胞基因轉(zhuǎn)染技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的。而許多基因的表達(dá)是無(wú)法通過(guò)轉(zhuǎn)染的方法來(lái)研究：基因表達(dá)有時(shí)空與組織的特異性；外源基因的表達(dá)受特異性有關(guān)順式作用序列的調(diào)控；因此，只有通過(guò)轉(zhuǎn)基因的動(dòng)物才有可能研究基因的表達(dá)、調(diào)控及基因之間的相互作用。進(jìn)行功能基因組學(xué)的研究，研究外源基因在動(dòng)物整體水平的表現(xiàn)調(diào)控規(guī)律。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物疾病模型可用來(lái)進(jìn)行疾病發(fā)病學(xué)和治療性研究。也可改變動(dòng)物基因使其表現(xiàn)型更適合人類(lèi)需要。還可以用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)一些人類(lèi)所需的生物活性物質(zhì)。免疫缺陷動(dòng)物

（Immunodeficientanimal）（一）定義：是指由于先天性遺傳突變或用人工方法,造成一種或多種免疫系統(tǒng)組成成分缺陷的動(dòng)物。（二）分類(lèi)：1、先天性免疫缺陷動(dòng)物：a.T淋巴細(xì)胞功能缺陷動(dòng)物：裸小鼠，裸大鼠b.B淋巴細(xì)胞功能缺陷動(dòng)物：CBA/N小鼠c.NK細(xì)胞功能缺陷動(dòng)物：Beige小鼠d.聯(lián)合免疫缺陷動(dòng)物：SCID小鼠等2、獲得性免疫缺陷動(dòng)物：猴、小鼠、貓等AIDS模型（三）裸小鼠（NudeMice）1、發(fā)現(xiàn)與發(fā)展1962年英國(guó)格拉斯哥醫(yī)院Grist在非近交系的小鼠中偶然發(fā)現(xiàn)有個(gè)別小鼠無(wú)毛。1966年證實(shí)是由于第11對(duì)染色體基因突變所致。1968年，Pantelouris解剖發(fā)現(xiàn)裸鼠失去了正常的胸腺。由于裸鼠原種抵抗力差，生育力低，壽命短，不能用于實(shí)際。和純系BALB/C，C3H，C57BL/6小鼠交配，不斷選育，獲得了三種近交系鼠（InbredNudeMice）新種。1969年Rygaard首先將人結(jié)腸腺癌移植裸小鼠獲得成功。裸鼠自發(fā)現(xiàn)以來(lái)，廣泛應(yīng)用于腫瘤學(xué)、免疫學(xué)和病毒學(xué)等多個(gè)學(xué)科的研究。2、生物學(xué)特點(diǎn)（1）一般特點(diǎn)純合子突變裸鼠（nu/nu）主要表現(xiàn)為無(wú)毛以及胸腺缺陷。雜合子小鼠（nu/+）各方面表現(xiàn)正常。體重小于同齡普通鼠，發(fā)育緩慢。必須養(yǎng)育在SPF環(huán)境中。繁殖方式：一般采用隱性純合子雄性與雜合子雌鼠交配（♂nu/nu×♀nu/+）。（2）解剖生理特點(diǎn)胸腺殘留一些上皮樣細(xì)胞；淋巴組織胸腺依賴(lài)區(qū)的淋巴細(xì)胞消失；外周血淋巴細(xì)胞減少。雖然有原始的T細(xì)胞，但缺乏成熟的T細(xì)胞。T細(xì)胞的輔助，抑制及殺傷功能不全。在混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)中無(wú)有絲分裂反應(yīng)，對(duì)刀豆素A或植物凝集素P無(wú)促分裂原應(yīng)答。無(wú)接觸敏感性，無(wú)移植排斥，無(wú)移植物抗宿主反應(yīng)。B細(xì)胞數(shù)量正常但功能有缺陷，合成的免疫球蛋白主要是IgM，只有少量IgG。粒細(xì)胞功能較低，NK細(xì)胞活性高。BALB/c-nu的胸腺昆明小鼠的胸腺

3、裸鼠的應(yīng)用裸鼠在腫瘤研究上的應(yīng)用：制作人類(lèi)腫瘤移植瘤模型人類(lèi)腫瘤移植于動(dòng)物的歷史免疫排斥問(wèn)題眼前房，腦內(nèi)，地鼠的頰囊等免疫逃避部位免疫抑制劑、射線(xiàn)照射的使用裸鼠作為人類(lèi)腫瘤受體腫瘤移植瘤模型在腫瘤基礎(chǔ)研究中的意義添加人為因子（致突變劑，癌基因，藥物等）觀(guān)察腫瘤病因及機(jī)理和治療。建立腫瘤細(xì)胞株：提供大量腫瘤組織供分析。診斷和預(yù)后：建立平行模型，明確診斷和跟蹤預(yù)后。個(gè)體化療有效試驗(yàn)：對(duì)于晚期和復(fù)發(fā)腫瘤有重要意義。藥物有效的標(biāo)準(zhǔn)：1.腫瘤不生長(zhǎng)；2.腫瘤生長(zhǎng)緩慢；3.腫瘤長(zhǎng)出后又消失；4.腫瘤無(wú)轉(zhuǎn)移；5.動(dòng)物壽命延長(zhǎng)。腫瘤移植瘤模型制作方法腫瘤組織塊或腫瘤細(xì)胞皮下移植腹腔內(nèi)或腎包膜下移植原位移植移植瘤模型成功制作的影響因素：腫瘤組織：

惡性程度：惡性和轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)瘤成功率較高種類(lèi)：細(xì)胞系成功率>活檢標(biāo)本來(lái)源：淋巴瘤、骨腫瘤等難獲成功部位：腫瘤塊的外周部接種易成活裸鼠：遺傳背景：胰腺癌接種BALB/c成功，NIH系失敗性別：雌激素依賴(lài)性腫瘤接種雄鼠生長(zhǎng)慢鼠齡：4-6周動(dòng)物健康狀態(tài)接種部位：原位移植成功率高，移植腫瘤與人類(lèi)原發(fā)瘤相似。有些腫瘤需要接種在特定的部位（對(duì)雌激素依賴(lài)的人乳腺癌MCF-7細(xì)胞系，接種乳腺脂肪墊才能成活）。其他：環(huán)境：細(xì)菌病毒可以影響NK細(xì)胞活性；接種時(shí)間越早越好，注意無(wú)菌操作。（2）裸鼠在醫(yī)學(xué)其他領(lǐng)域的應(yīng)用：免疫學(xué)：研究體液免疫與細(xì)胞免疫的關(guān)系，研究免疫相關(guān)疾病寄生蟲(chóng)：寄生蟲(chóng)感染的動(dòng)物模型，美洲錐蟲(chóng)，卡氏肺囊蟲(chóng)皮膚：魚(yú)鱗病免疫缺陷模型：麻風(fēng)，結(jié)核

嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷小鼠

（SeverCombinedImmunodeficientMice,SCIDmice）1983年Bosma首次報(bào)告，來(lái)源于C.B-17小鼠。由于第16對(duì)染色體隱性基因突變，純合突變導(dǎo)致淋巴細(xì)胞抗原受體基因VDJ區(qū)域重排的重組酶活性異常，基因重排時(shí)斷裂無(wú)法正常連接，從而影響B(tài)、T細(xì)胞的正常