微衛(wèi)星標記法對粗毛型長毛兔遺傳多樣性分析

微衛(wèi)星dna（微衛(wèi)星dna），也稱為短串聯(lián)重復（sr）或簡單重復序列（sr），由側(cè)翼序列和連接重復的核心序列組成。串聯(lián)重復的核心序列長度通常為1.6bp。由于微衛(wèi)星標記具有等位基因間呈共顯性,廣泛存在于基因組中,具有豐富的多態(tài)性、相對保守性、容易檢測、省時、重復性好等特點,被廣泛的應用于親子鑒定及交配系統(tǒng)研究、種群遺傳結(jié)構(gòu)分析、輔助種群調(diào)查、種群動態(tài)和物種進化歷史揭示以及近緣物種及雜交個體鑒別等方面[1～3]。聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO)在其持續(xù)發(fā)展和管理動物遺傳資源的戰(zhàn)略計劃中,也將微衛(wèi)星標記作為優(yōu)先推薦的分析工具。蘇Ⅰ系粗毛型長毛兔,是由江蘇省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所選育而成。1988～1990年,在德系安哥拉兔選育的基礎上,導入含粗毛率高的新西蘭白兔、德國大白兔和法系安哥拉兔等血統(tǒng),經(jīng)過3代以上雜交,選出理想個體進行世代選育。1991～1995年開展自群橫交固定世代選育。目前利用微衛(wèi)星標記分析蘇Ⅰ系粗毛型長毛兔和美系獺兔遺傳多樣性的研究還較少。本試驗采用微衛(wèi)星標記技術,研究蘇Ⅰ系粗毛型長毛兔和美系獺兔的遺傳多樣性,旨在為我國家兔遺傳資源的評價、保護和開發(fā)利用提供理論基礎。1材料和方法1.1粗毛兔的制備在江蘇省農(nóng)業(yè)科學院畜牧研究所種兔場隨機抽取健康、發(fā)育正常的蘇Ⅰ系粗毛型長毛兔47只,美系獺兔35只,耳緣靜脈采血3mL,肝素鈉抗凝,于﹣20℃下冷凍保存,備用。1.2提取的胎盤dna基因組總DNA提取采用收集白細胞方法及經(jīng)典的酚-氯仿萃取法。1.3pcr反應條件根據(jù)兔的微衛(wèi)星引物,本試驗共設計了15對引物,由上海生工生物工程公司合成。引物具體情況如表1。反應體積為20μL,其中模板50～100ng,10×Buffer2μL,dNTP1.5μL,上、下游引物各1μL,模板1μL,Taq酶0.2μL,ddH2O13.3μL。反應條件為:95℃預變性5min,94℃變性50s,53～58℃復性50s,72℃延伸50s,35個循環(huán);最后72℃延伸10min。擴增產(chǎn)物經(jīng)10%聚丙烯酰胺凝膠100V電泳6～8h,銀染拍照。根據(jù)不同基因片段電泳遷移率的不同,利用Onedscan成像軟件計算其片斷長度。試驗所用TaqDNA聚合酶和dNTPs均購自寶生物工程(大連)有限公司,采用pBR322DNA/MspImarkers作為分了量的標準對照。1.4固定指數(shù)計算:點線面內(nèi)容信息含量背景采用Microsatellite-Tools軟件計算該群體的等位基因頻率、期望雜合度、多態(tài)信息含量,利用Fstat軟件計算該群體的固定指數(shù),利用Excel計算各位點的有效等位基因數(shù)及標準差。2結(jié)果與分析2.1美、蘇系粗毛兔的等位基因美系獺兔和蘇Ⅰ系粗毛型長毛兔15個微衛(wèi)星座位均呈現(xiàn)出多態(tài)性,每個微衛(wèi)星座位的等位基因數(shù)均在3～7個之間,美系獺兔共檢測到69個等位基因,蘇Ⅰ系粗毛型長毛兔檢測到77個等位基因,各等位基因片段大小在114～434bp之間。在15個微衛(wèi)星座位上,美系獺兔的平均等位基因數(shù)為4.6000±1.0556個,有效等位基因數(shù)3.5520±0.9703個;蘇Ⅰ系粗毛型長毛兔的平均等位基因數(shù)為5.1333±1.2459個,有效等位基因數(shù)3.7506±0.8081個(見表2)。美系獺兔的等位基因最多的座位是Sol44,有7個等位基因,蘇Ⅰ系粗毛型長毛兔的等位基因最多的座位是12L5A6和Sol33,各有7個等位基因;美系獺兔的等位基因最少的座位是D7utr5,有3個等位基因,蘇Ⅰ系粗毛型長毛兔的等位基因最少的座位是Sat8,有3個等位基因。2.2蘇系粗毛兔各座的期望雜合度和多態(tài)信息含量根據(jù)15個微衛(wèi)星座位的等位基因頻率,計算得到美系獺兔和蘇Ⅰ系粗毛型長毛兔群體的基因雜合度和多態(tài)信息含量等(見表3)。由表3可知,美系獺兔各座位的期望雜合度在0.3979～0.8360之間,群體平均值為0.7067±0.1030;多態(tài)信息含量范圍在0.3524～0.8021之間,群體平均值為0.6501±0.1050;期望雜合度和多態(tài)信息含量最高的座位是Sol44,分別0.8360和0.8021,最低的座位是D7Utr5,分別為0.3979和0.3524。蘇Ⅰ系粗毛型長毛兔各座位的期望雜合度在0.5708～0.8126之間,群體平均值為0.7270±0.0709;多態(tài)信息含量范圍在0.4980～0.7763之間,群體平均值為0.6750±0.0824;期望雜合度和多態(tài)信息含量最高的座位是Sol33,分別為0.8126和0.7763,最低的座位是Sat8,分別為0.5708和0.4980。美系獺兔與蘇Ⅰ系粗毛型長毛兔的平均群體近交系數(shù)分別為-0.2580±0.0033和-0.2300±0.0033。總?cè)后w的F統(tǒng)計量見表4?？偨幌禂?shù)(Fit)為-0.1195±0.0500;群體分化系(Fst)為0.0887±0.0230,即群體間的分化系數(shù)為8.87%,有12個座位顯著或極顯著地貢獻于這個結(jié)果;群體內(nèi)的近交系數(shù)(Fis)為-0.2272±0.0430,有1個座位表現(xiàn)出極顯著的雜合子缺失。3討論3.1u3000主要基因的多態(tài)性微衛(wèi)星標記是由微衛(wèi)星的核心序列與其兩側(cè)的側(cè)翼序列組成,側(cè)翼序列使微衛(wèi)星位點具有特異性,而微衛(wèi)星本身重復單位數(shù)的變異使其具有多態(tài)性,一般來講,微衛(wèi)星標記核心序列重復數(shù)越多,其變異就越大,該位點的等位基因數(shù)也就越多,重復次數(shù)與多態(tài)性存在正相關。有效等位基因數(shù)是基因純合度的倒數(shù),反映了等位基因的相互影響,也可作為群體遺傳變異的一個指標。本試驗中,美系獺兔微衛(wèi)星標記的平均等位基因數(shù)為4.6000±1.0556個,最多為7個,最少為3個,平均有效等位基因數(shù)為3.5520±0.9703,蘇Ⅰ系粗毛型長毛兔微衛(wèi)星標記的平均等位基因數(shù)為5.1333±1.2459個,最多為7個,最少為3個,平均有效等位基因數(shù)為3.7506±0.8081,基因數(shù)并沒有表現(xiàn)出明顯的比例關系。Valdes認為在人類重復次數(shù)低于5的微衛(wèi)星不能檢測出多態(tài)性。根據(jù)微衛(wèi)星選擇標準,每個微衛(wèi)星座位至少應有4個等位基因才能較好地用于遺傳分析,因此除了美系獺兔中的D7utr5位點和蘇Ⅰ系粗毛型長毛兔中的Sat8座位,兩個兔種中的其他位點均可用于遺傳分析,該結(jié)果與李鷹、龔明川試驗結(jié)果基本一致。但龔明川報道Sat8微衛(wèi)星座位有4個等位基因,而本試驗中蘇Ⅰ系粗毛型長毛兔的該座位等位基因數(shù)僅為3,其原因可能是不同兔品種間所存在的差異,另一個種原因可能是本試驗的樣本數(shù)不夠大。Botstein等提出了衡量基因變異程度高低的多態(tài)信息含量指標,PIC>0.5時,該基因座為高度多態(tài)基因座,0.25<PIC<0.5時為中度多態(tài)基因座,PIC<0.25時為低度多態(tài)基因座。期望雜合度和多態(tài)信息含量都是群體內(nèi)遺傳變異的測度,其值的高低反映了群體內(nèi)個體的均勻度。數(shù)值高,說明群體內(nèi)遺傳變異較大;數(shù)值低則反映群體內(nèi)的變異較小。本試驗中,美系獺兔除了D7Utr5座位是中度多態(tài)基因座,其他14個微衛(wèi)星位點都具有高度的多態(tài)性。在蘇Ⅰ系粗毛型長毛兔中,除了Sat8座位是中度多態(tài)基因座,其他均為高度多態(tài)基因座。美系獺兔和蘇Ⅰ系粗毛型長毛兔的群體平均多態(tài)信息含量分別為0.6501±0.1050,0.6750±0.0824,均表現(xiàn)出較高的遺傳多樣性,說明群體內(nèi)遺傳變異較大,表明這些微衛(wèi)星座位均可作為有效的遺傳標記用于兩個家兔品種遺傳多樣性的分析。3.2從長毛兔的fis值Fis指亞群內(nèi)個體之間的近交系數(shù),取值范圍均為-1～1。當Fis值為極顯著的正值時,則表示群體內(nèi)近交程度較嚴重,如是極顯著的負值時,群體內(nèi)觀測雜合度大于期望雜合度,則表示群體內(nèi)存在遠交。本研究得出美系獺兔和蘇Ⅰ系粗毛型長毛兔Fis值為負值,分別為-0.2580±0.0033(P<0.001),-0.2300±0.0033(P<0.001),說明兩個家兔群體內(nèi)雜合體較多,基因交流頻繁,提示兩個群體內(nèi)個體均很少發(fā)生近交。同時,在兩個家兔群體中,均發(fā)生一定的雜合子缺失現(xiàn)象,可能與下列兩個原因有關:一是這些位點