基于生物酶法的葵花脂粕中膳食纖維的提取研究

食物纖維是指由干物質(zhì)組成的復(fù)雜混合物。根據(jù)其一般特點(diǎn)，可分為脫水食品纖維（sdf）和不透水食品纖維（idf）。醫(yī)學(xué)研究表明,膳食纖維對(duì)人體的健康,有著極為重要的生理功能。它被營養(yǎng)學(xué)家列為“第七營養(yǎng)素”。膳食纖維有減肥、通便、防治便秘的功能,對(duì)降糖、降脂、防治糖尿病和心血管疾病功能也有一定的作用。此外,大部分膳食纖維都有確定的抑制結(jié)腸癌的作用。自然界中富含纖維的原料很多,國外目前研究過的膳食纖維包括谷物纖維、果蔬纖維、豆類纖維、微生物纖維,其他天然纖維和合成纖維六大類約30種,我國對(duì)其研究開發(fā)上起步較晚,主要集中在對(duì)麥麩纖維、豆纖維和甜菜纖維三種的研究上,關(guān)于從葵花脫脂粕中提取膳食纖維的研究和相關(guān)報(bào)道還很少。膳食纖維的提取方法主要有粗分離法、化學(xué)分離法、膜分離法、酶法、化學(xué)試劑和酶結(jié)合分離法。本實(shí)驗(yàn)用植物精提酶和酸性蛋白酶作用于葵花籽,探討各主要因素對(duì)得率的影響。并將提取結(jié)果與化學(xué)法提取結(jié)果相比較。本實(shí)驗(yàn)主要是比較化學(xué)法和生物酶法提取工藝的優(yōu)劣,其中主要側(cè)重對(duì)酶法的研究,未對(duì)化學(xué)法作深入研究。1材料和方法1.1材料、試劑和機(jī)器1.1.1植物精提復(fù)合酶葵花籽仁。鹽酸;氫氧化鈉;蒸餾水;pH試紙;5%雙氧水;SPE-008植物精提復(fù)合酶寧夏夏盛實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司;酸性蛋白酶肇東市日成酶制劑有限公司。1.1.2主要設(shè)備制造有限公司超聲波細(xì)胞粉碎儀寧波新芝生物科技股份有限公司;SHB-III循環(huán)水式多用真空泵鄭州長城科工貿(mào)有限公司;HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋江蘇金壇榮華儀器制造有限公司;DB-2型不銹鋼電熱板江蘇金壇榮華儀器制造有限公司;DHG-9240型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;HZS-H水浴振蕩器哈爾濱市東明醫(yī)療儀器廠制造;FD-1C冷凍干燥機(jī)北京德天佑科技發(fā)展有限公司。1.2方法1.2.1原料的制備將葵花籽仁去雜,所得凈仁研磨,稱量加水,超聲波破碎20min,離心去油,收集沉淀置冷凍干燥機(jī)中干燥,干燥后過140目篩,備用。1.2.2化學(xué)法提取食纖維1.2.2.膳食纖維得率的測(cè)定稱取5g葵花脫脂粕于燒杯中,加入40ml40%NaOH,后置水浴中加熱2h,浴溫控制在40℃左右,然后冷卻至室溫,用1:1鹽酸中和至中性,抽濾后用水洗請(qǐng),濾渣收集于燒杯中,并加入5%的雙氧水40ml,在水浴鍋中加熱1h,溫度控制在40℃,抽濾,洗滌,再抽濾,濾渣磨成粉末。稱量,并計(jì)算膳食纖維得率。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為三次平行實(shí)驗(yàn)的平均值。1.2.2.膳食纖維的吸水性用電子天平稱取一定質(zhì)量的葵花膳食纖維(M1)于燒杯中,加入水至全部浸濕,稱量其吸水后的質(zhì)量(M2),再抽濾,濾渣置于燒杯中,再讓其吸水直至M2恒重,由公式計(jì)算出葵花膳食纖維的吸水性。1.2.3生物酶法提取食物纖維1.2.3.菊花精提復(fù)合酶的制備稱取處理后的葵花脫脂粕5g于高型燒杯中,加50ml蒸餾水,將高型燒杯放在電熱爐上加熱煮沸,使其充分吸水膨脹,15min后取下燒杯冷卻至室溫,在托盤天平上稱量,補(bǔ)充水分,使總的質(zhì)量與煮沸前相等,記為M1。在電熱爐上稍微加熱升溫至60℃,用1mol/L的HCl溶液和0.5mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值為5.0±0.2,將燒杯放在49℃的恒溫水浴箱里,加適量植物精提復(fù)合酶,放在水浴振蕩器中振蕩反應(yīng),溫度為49℃左右,達(dá)到所需時(shí)間t1后取下,用140目篩用清水沖洗多次,洗去酶解液,收集葵花脫脂粕于原燒杯中。然后調(diào)節(jié)溫度為40℃,用1mol/LHCl溶液和0.5mol/LNaOH溶液調(diào)節(jié)pH值為2.5~5.0之間,在40℃恒溫水浴箱內(nèi),加入蛋白酶,在水浴振蕩器中反應(yīng),溫度為40℃左右,達(dá)到所需時(shí)間t2后,用140目篩洗滌酶解液多次,收集。在電熱爐上加熱煮沸10min滅酶;最后放于105~110℃鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)脫水干燥至恒重,稱量M2,計(jì)算膳食纖維得率。1.2.3.2.吸水性測(cè)定方法同化學(xué)法。1.3實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)影響酶法提取膳食纖維的因素很多,本實(shí)驗(yàn)主要對(duì)植物精提復(fù)合酶的酶解時(shí)間和用量、酸性蛋白酶的酶解時(shí)間和用量作了研究。1.3.1單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)針對(duì)生物酶法各因素對(duì)得率的影響,作單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)。1.3.1.復(fù)合酶用量的確定室溫下,pH7,料液比為1:10,用水浸提均為5g的脫脂粕,時(shí)間為參數(shù),以膳食纖維提取率為考察目標(biāo),確定最佳酶解時(shí)間。復(fù)合酶的用量確定為0.4%;蛋白酶量,蛋白酶酶解時(shí)間分別確定為0.3%,45min。1.3.1.蛋白酶量的確定把復(fù)合酶制劑的量,復(fù)合酶解時(shí)間,分別確定為0.4%,45min,;蛋白酶量確定為0.3%。在此基礎(chǔ)上探索酸性蛋白酶酶解時(shí)間對(duì)膳食纖維得率的影響。1.3.1.蛋白酶制劑的用量把復(fù)合酶的酶解時(shí)間確定為45min。蛋白酶制劑的用量與酶解時(shí)間分別確定為0.3%、45min。在此基礎(chǔ)上探索植物精提復(fù)合酶酶用量對(duì)膳食纖維得率的影響。1.3.1.蛋白酶酶解時(shí)間的確定把混合酶制劑的量,混合酶解時(shí)間分別確定為0.4%,45min;蛋白酶的酶解時(shí)間確定為45min。在此基礎(chǔ)上探索酸性蛋白酶酶用量對(duì)膳食纖維得率的影響。1.3.2正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)1.3.2.1.因素水平表由以上單因素的試驗(yàn)結(jié)果對(duì)生物酶法各因素對(duì)得率的綜合影響,設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)對(duì)正交試驗(yàn)進(jìn)行分析。1.3.2.2.試驗(yàn)條件根據(jù)因素水平表列出L9(33)正交試驗(yàn)方案,見表3。以膳食纖維的得率為考察指標(biāo),確定最佳提取條件。試驗(yàn)數(shù)據(jù)為3次平行試驗(yàn)的平均值。2結(jié)果與分析2.1纖維原料的質(zhì)量由表2可以看出,化學(xué)法提出的膳食纖維吸水性比較好,平均值達(dá)到305%,說明該法提出的膳食纖維的質(zhì)量相對(duì)較好。但是,用化學(xué)法提取膳食纖維的得率不是很高,平均值為55.9%。2.2單因素試驗(yàn)的結(jié)果和分析2.2.1酶解時(shí)間對(duì)粗膳食纖維得率的影響由表3可以看出,蛋白酶-淀粉酶復(fù)合酶酶解時(shí)間在1.5~3.5h之間時(shí),粗膳食纖維的得率是隨著酶解時(shí)間的延長而升高的,當(dāng)酶解時(shí)間達(dá)到2.5h時(shí),膳食纖維得率達(dá)到最大。然后隨著酶解時(shí)間的延長,膳食纖維的得率反而降低。2.2.2酶解時(shí)間的確定由表4可以看出,蛋白酶酶解時(shí)間在15~45min之間,膳食纖維的得率隨著時(shí)間的增加而增加,其中,在15~30min期間得率增長緩慢;在30~45min之間得率增長很快,達(dá)到82%;45~60min期間得率下降非常緩慢,幾乎不變;此后繼續(xù)延長酶解時(shí)間,得率迅速下降。酶解時(shí)間為45min為最佳酶解時(shí)間。其原因?yàn)?反應(yīng)時(shí)間延長可使酶與蛋白質(zhì)分子充分作用,從而形成更多的共價(jià)交聯(lián)使得率增加,達(dá)到一定時(shí)間,蛋白酶充分降解,而且由于酶的專一性和高效性,以及混合酶的殘留等綜合考慮,在酶解時(shí)間繼續(xù)延長時(shí),膳食纖維得率又有些微的下降,本次試驗(yàn)確定酶解時(shí)間45min為好。2.2.3混和酶用量對(duì)粗膳食纖維得率的影響從表5可以看出,混合酶用量在0.1%~0.4%之間粗膳食纖維得率是逐漸增長的,在0.4%時(shí)粗膳食纖維得率最高為78%;然后隨著混和酶用量的增加粗膳食纖維得率反而迅速下降。這是因?yàn)榛旌厦钢苿┑募尤?酶迅速地將葵花脫脂粕中的部分淀粉分解,提取的膳食纖維含一定的淀粉,所以得率高,隨著酶劑量的增加和反應(yīng)的進(jìn)行,葵花脫脂粕中的淀粉被充分降解,膳食纖維的純度提高,但得率下降。2.2.4蛋白質(zhì)分子肽鏈的變化由表6可以看出,當(dāng)?shù)鞍酌赣昧吭?.1%~0.3%之間時(shí),隨蛋白酶用量的增加,得率迅速增加;當(dāng)?shù)鞍酌赣昧吭?.3%~0.5%之間時(shí),得率隨著酶量的增加而減少,這是因?yàn)殡S著蛋白酶的加入,蛋白酶與葵花脫脂粕中蛋白質(zhì)分子肽鏈作用增加,但此時(shí)葵花脫脂粕中蛋白質(zhì)分子并沒有完全作用徹底,即得到的纖維中仍含有一部分蛋白質(zhì)。隨著蛋白酶的繼續(xù)加入,蛋白酶與葵花脫脂粕中蛋白質(zhì)分子肽鏈的接觸機(jī)會(huì)增強(qiáng),即在同一時(shí)間內(nèi)分解的肽鏈數(shù)不斷增加,蛋白質(zhì)分子降解充分,此時(shí)提取出的膳食纖維純度很高,也可能是酶與蛋白質(zhì)的作用以趨于飽和狀態(tài)。而且葵花脫脂粕中的油分提取并不完全,會(huì)影響酶活力的充分發(fā)揮。還有可能是膳食纖維中含有碳氮鍵,酶使之降解,降低了得率,再加之有部分水溶性膳食纖維的流失都造成了膳食纖維得率是先增加而后減少的。所用到的酶的專一性和高效性對(duì)最后的結(jié)果有很大的影響,所以在蛋白酶用量為0.3%時(shí),膳食纖維得率最高為82%。2.3工藝參數(shù)配比對(duì)膳食纖維得率的影響從以上對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果的分析可以看出,RC>RB>RA>RD。即在生物酶法提取膳食纖維的各個(gè)影響因素中,影響程度大小為:植物精提酶用量>蛋白酶酶解時(shí)間>植物精提酶酶解時(shí)間>蛋白酶用量,植物精提酶用量對(duì)膳食纖維的得率影響最大,酸性蛋白酶用量對(duì)膳食纖維得率在這幾個(gè)因素中影響最小,較優(yōu)的工藝參數(shù)組合為:A2、B2、C3、D1,即植物精提酶解時(shí)間為2.5h,混合酶酶解時(shí)間為0.4%,酸性蛋白酶用量為0.2%。酸性蛋白酶酶解時(shí)間為45min,此時(shí)膳食纖維的得率為78.3%。3結(jié)論和討論3.1不同生物酶法與生物酶法的膳食纖維在不同的溫度下的吸水性能化學(xué)法提出的膳食纖維色澤為純白色,吸水性好,得率較低。而用生物酶法提出的膳食纖維色澤為淺黃色,吸水性相對(duì)化學(xué)法較差,但得率較高。即化學(xué)法得到的膳食纖維的質(zhì)量要高于生物酶法得到的膳食纖維。3.2酸性蛋白酶用量及酶解時(shí)間植物精提酶用量為0.4%,酶解時(shí)間為2.5h,酸性蛋白酶用量0.2%,酶解時(shí)間45min。以上述條件提取的膳食纖維得率可達(dá)78.3%。3.3加速溶劑提取但